方 芳 朱錦明

1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院 (221004)；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州婦幼保健院

子癇前期常伴隨水腫、頭痛、惡心、胃痛及嘔吐等癥狀，分娩結(jié)束后通常會消失[1]。子癇前期會對妊娠女性肝、腎等臟器功能及大腦功能造成損傷，同時可導(dǎo)致胎兒供血量和供氧量不足，嚴重威脅胎兒和母親生命健康[2]。目前，學(xué)術(shù)界普遍認為子癇前期可能是由胎盤血液循環(huán)出現(xiàn)紊亂引起，但其確切發(fā)病機制尚未研究清楚。有研究報道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)影響胎盤功能、胎盤滋養(yǎng)細胞分化及凋亡，而子癇前期發(fā)病期間胎盤血氧量不足等有害因素會啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)調(diào)節(jié)功能異常是引發(fā)子癇前期的發(fā)病機制之一[3]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)與蛋白質(zhì)折疊及組裝，P53蛋白主要與細胞凋亡有關(guān)，以上兩種蛋白分子被認為與胎盤滋養(yǎng)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)凋亡途徑緊密關(guān)聯(lián)[4-5]。本研究通過測定GRP78、P53蛋白在不同類型子癇前期孕婦血清及胎盤組織中的表達，探討其生物學(xué)作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，且患者及家屬知情同意后，選取60例2018年1月—2018年12月本院婦產(chǎn)科接受治療的子癇前期妊娠女性為研究對象。納入標準：①診斷標準《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》[6]；②年齡23～45歲；③單胎妊娠；④均剖宮產(chǎn)分娩。排除標準：①合并糖尿病、慢性高血壓、心血管疾病及自身免疫疾?。虎诤喜⑿母文I功能障礙；③合并其他妊娠并發(fā)癥。60例均為重度子癇前期患者，其中早發(fā)子癇前期30例(早發(fā)組)，年齡(29.3±5.8)歲，分娩孕周(33.2±6.2)周；晚發(fā)子癇前期30例(晚發(fā)組)，年齡(28.6±5.3)歲，分娩孕周(36.7±7.2)周。另外選取同期本院健康妊娠女性30例為對照組，年齡(29.53±6.28)歲，分娩孕周(39.5±7.8)周。3組年齡比較無差異(P>0.05)，分娩孕周比較有差異(P<0.05)。

1.2 蛋白檢測

1.2.1血清GRP78、P53蛋白采集3組外周靜脈血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及P53蛋白水平，試劑盒由cloud-clone corp公司生產(chǎn)，儀器采用瑞士Tecan公司的Freedom Evolyzer-2200型全自動酶免疫分析儀。

1.2.2胎盤組織GRP78、P53蛋白中央帶母體面至胎兒面1.0cm×1.0cm×1.0cm，避開梗死及鈣化區(qū)，去除母體面約4mm脫膜組織，用無菌生理鹽水清洗處理后分裝2管，各0.1g。取其中1份10%福爾馬林固定，24h后常規(guī)石蠟包埋切片，依次脫蠟、水化、過氧化物酶阻斷、抗原修復(fù)、PBS漂洗，免疫組織化學(xué)染色(SP)檢測GRP78、P53蛋白水平。GRP78一抗為兔抗人單克隆抗體，按1:100稀釋；P53蛋白一抗為鼠抗人單克隆抗體，按1:50稀釋，二抗為山羊免抗IgG，用二氨基聯(lián)苯胺呈色，光學(xué)顯微鏡下觀察。另一份胎盤組織迅速用液氮冷凍， -80℃保存，用半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測GRP78及P53mRNA表達。PCR循環(huán)參數(shù)分別為預(yù)變性5min(94℃)、變性0.5min(94℃)、退火0.5min(60℃)、延伸0.5min(72℃)，共進行35個循環(huán)。GRP78上游引物5'-ATCAGGGCAACCGCATCACACC-3'，下游引物5'-ACGCCTCGGCAGTTTCCTTCATTT-3'，內(nèi)部參照上游引物5'-CAGGCGTAGGAATATGGAC-3'，下游引物5'-CGTGGCTTTACTTGGAGAA-3'；P53上游引物5'-GACCTGGTCCTCTGACTGCT-3'，下游引物5'-GATACGGCCAGGCATTGAAG-3'，內(nèi)部參照上游引物5'-GATTGGAATCTGGCTACT-3'，下游引物5'-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用spss23.0軟件統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用F檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中GRP78、P53蛋白水平

血清GRP78、P53蛋白水平對照組低于早發(fā)組和晚發(fā)組(P<0.05)，早發(fā)組與晚發(fā)組無差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組血清中GRP78、

2.2 胎盤組織中GRP78 mRNA、P53 mRNA表達

胎盤組織中GRP78 mRNA、P53 mRNA表達水平早發(fā)組和晚發(fā)組均高于對照組(P<0.05)，早發(fā)組和晚發(fā)組比較無差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組胎盤組織中GRP78 mRNA、P53 mRNA表達水平

2.3 胎盤組織中GRP78、P53蛋白表達組化分析

3組胎盤組織中均有GRP78、P53蛋白表達。GRP78 蛋白主要表達于細胞質(zhì)，呈棕黃色染色，對照組表達在黃色和淺棕色，早發(fā)組和晚發(fā)組表達在深棕色和淺棕色區(qū)域，早發(fā)組和晚發(fā)組比對照組棕色顆粒表達增高。P53蛋白主要表達于細胞滋養(yǎng)層細胞、絨毛間質(zhì)滋養(yǎng)層細胞及合體滋養(yǎng)層細胞。早發(fā)組和晚發(fā)組胎盤組織中GRP78、P53蛋白陽性表達高于對照組(P<0.05)，早發(fā)組和晚發(fā)組比較無差異(P>0.05)，見表3。

表3 胎盤組織中GRP78、P53蛋白表達[例(%)]

3 討論

子癇前期屬妊娠期特發(fā)并發(fā)癥，輕度無明顯癥狀，但會導(dǎo)致患者體重快速增加，且手部和面部出現(xiàn)不同程度突發(fā)性腫脹；重度子癇前期可以導(dǎo)致嚴重頭痛、呼吸障礙、視力障礙、排尿減少及腹痛等癥狀[7]。近年研究報道，質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子肌醇依賴酶1α(IRE1α)、GRP78 及內(nèi)皮素 -1(ET-1)等在子癇前期表達異常，并參與子宮螺旋動脈重建及滋養(yǎng)細胞的增殖與分化，導(dǎo)致子癇前期發(fā)生[8-9]。本研究通過對子癇前期孕婦血清及胎盤組織中GRP78、P53蛋白水平變化，探討其臨床意義。

GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種應(yīng)激蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，GRP78可通過提升自身表達量控制蛋白質(zhì)折疊與轉(zhuǎn)運來阻止細胞凋亡，從而維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，GRP78蛋白、GRP78mRNA在子癇前期妊娠患者血清及胎盤組織中表達量均高于健康孕婦，但在早發(fā)與晚發(fā)組未見差異，提示GRP78參與了子癇前期發(fā)病機制。分析認為：是由于在子癇前期患者機體內(nèi)存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，使組織處于缺氧、低糖環(huán)境，誘導(dǎo)GRP78大量生成，造成GRP78升高[11]。王聳等[12]研究了GRP78蛋白在子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)子癇前期、早發(fā)型及晚發(fā)型子癇前期胎盤組織中GRP78蛋白均呈現(xiàn)高表達，且子癇前期程度組間未見差異，與本研究結(jié)果相符。

P53蛋白是控制細胞周期及凋亡的抑癌基因P53的表達產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)細胞凋亡、DNA修復(fù)及抑制血管生成等作用。有研究證實，P53蛋白在胎盤滋養(yǎng)細胞中表達水平存在變化，可能與胎盤形成與浸潤有關(guān)[13]。王喜慧等對子癇前期發(fā)病及嚴重程度與 VEGF和P53表達相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，患者血清及胎盤組織中VEGF與P53呈高度負相關(guān)，證實了P53通過調(diào)節(jié)VEGF水平引發(fā)血管內(nèi)皮功能紊亂，進一步導(dǎo)致子癇前期發(fā)生[14]。本研究檢測結(jié)果顯示，子癇前期患者中P53表達高于對照組，但早發(fā)型與晚發(fā)型無明顯差異，提示P53參與了子癇前期的發(fā)生。分析認為：通過促進滋養(yǎng)細胞凋亡而影響胎盤形成所致P53表達升高。此外，有研究指出，在長時間缺氧狀態(tài)下，P53可通過p21途徑在轉(zhuǎn)錄因子E2F上發(fā)揮直接作用，抑制血管內(nèi)皮生長因子表達，加重血管內(nèi)皮損傷，繼而加重子癇前期病情[15]。

本研究分析顯示，血清中GRP78、P53表達有明顯相關(guān)性，是由于P53表達可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，促使大量縮血管物質(zhì)在血液中釋放，造成血管痙攣收縮，滋養(yǎng)細胞缺氧缺血，產(chǎn)生大量應(yīng)激刺激，誘導(dǎo)GRP78大量表達，而GRP78的大量生產(chǎn)又加重機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成血管損傷，兩者互相聯(lián)系進一步加重病情。

綜上所述，子癇前期孕婦血清及胎盤組織中GRP78、P53蛋白及GRP78mRNA、P53mRNA均呈高表達，但表達量與病情無明顯相關(guān)性，預(yù)示GRP78、P53蛋白水平變化及其基因表達異?？赡芘c子癇前期發(fā)病機制有關(guān)，可作為子癇前期早期預(yù)測指標，為臨床治療提供有效參考。但本研究由于時間限制，僅觀察了重度子癇前期患者，未分析血清GRP78、P53與患者臨床指標和妊娠結(jié)局關(guān)系，且樣本量過少，對上述不足需有待進一步研究。