于秋紅 高召軍 能 婷 齊永秀

(山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

舒腦欣滴丸是由川芎、當(dāng)歸兩味藥制成，具有理氣活血、化瘀止痛之功效[1]。阿魏酸是當(dāng)歸中的重要藥效成分之一，具有抑制子宮平滑肌收縮，抗血小板凝集和抗血栓，抗心肌缺血和擴(kuò)張血管作用[2-3]。藥物血漿蛋白結(jié)合率是臨床合理用藥的依據(jù),是藥物體內(nèi)重要參數(shù)之一，可直接影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，從而影響其作用強(qiáng)度與時(shí)間，是藥代動(dòng)力學(xué)、分子藥理學(xué)等學(xué)科研究的重要課題之一[4]。目前，用于測(cè)定阿魏酸含量的方法較多[5-7]，而測(cè)定阿魏酸血漿結(jié)合率的文獻(xiàn)較少，本次實(shí)驗(yàn)采用HPLC法和超濾法測(cè)定舒腦欣滴丸中阿魏酸含量和血清蛋白結(jié)合率，為臨床安全合理用藥和新藥的研究提供數(shù)據(jù)。

1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀；2998二極管陣列檢測(cè)器；FR224CN型電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；島津UV-2700型紫外分光光度計(jì)；凱特離心機(jī)(鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；XW-80A旋渦混合儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；Millipore 10K超濾管(北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司)；阿魏酸對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：H27J7L16718)；舒腦欣滴丸(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；人血清白蛋白(HAS，250 mg，Sigma公司)；甲醇(色譜純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；乙酸(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：VenusilMPC18(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-乙酸(40∶59.6∶0.4)；檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm；柱溫為30℃，流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容到刻度，搖勻，得到濃度為200 μg·mL-1的阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2樣品溶液的制備 取舒腦欣滴丸20丸，精密稱(chēng)定，計(jì)算平均丸重，再隨機(jī)取5丸粉粹，稱(chēng)重后置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇適量，超聲處理30 min，冷卻，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.2.3磷酸鹽緩沖溶液的制備(PBS，pH=7.4) 稱(chēng)取磷酸二氫鈉2.08 g，十二水磷酸氫二鈉19.028 g，氯化鈉4.4 g，置于1000 mL的容量瓶中，加入水適量，超聲溶解后加水稀釋至刻度，搖勻，即得到pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液。

2.2.4人血清白蛋白溶液的制備 精密稱(chēng)取人血清白蛋白0.08125 g，置25 mL的容量瓶中，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并稀釋至刻度，可得3.25 mg·mL-1的人血清白蛋白溶液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5人血清白蛋白對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取阿魏酸對(duì)照品1 mg，置10 mL容量瓶中，加人血清白蛋白溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為100 μg·mL-1的人血清白蛋白對(duì)照品溶液；再精密吸取適量，稀釋成50、10、5 μg·mL-1的人血清白蛋白對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取500 μl人血清白蛋白溶液置超濾管中，于10000 r/min，離心25 min，制得空白血漿溶液，取空白溶液、阿魏酸對(duì)照品、樣品溶液、空白血漿、空白血漿+阿魏酸對(duì)照品、空白血漿+樣品溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)阿魏酸峰型良好，互相之間無(wú)雜質(zhì)干擾(圖1)，表明該試驗(yàn)方法專(zhuān)屬性較好。

a：空白溶液；b：阿魏酸對(duì)照溶液；c：舒腦欣滴丸樣品溶液；d：空白血漿溶液；e：血漿+阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品；f：血漿+舒腦欣滴丸樣品溶液

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.5、3、5 mL，分別放置于10 mL的容量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，即得含量為5 、10、30、60、100 μg·mL-1的阿魏酸對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各峰面積，以對(duì)照品溶液濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=2000000X+753307，r=0.9998，結(jié)果表明，阿魏酸溶液濃度在5～100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計(jì)算RSD為1.29%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下舒腦欣滴丸樣品溶液室溫放置，分別于0、2、4、8、12 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果測(cè)得阿魏酸峰面積RSD值為1.09%，小于2.00%，表明舒腦欣滴丸樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定；取“2.2.5”項(xiàng)下50、10、5 μg·mL-1人血清白蛋白對(duì)照品溶液室溫放置于2、4、6、8、12 h，分別吸取0.5 mL，置于超濾管中，于4℃，10000 r/min，離心25 min，得到不同質(zhì)量濃度的超濾液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果測(cè)定阿魏酸的峰面積RSD均不超過(guò)5%，表明人血清白蛋白樣品室溫12 h穩(wěn)定。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn) 分別稱(chēng)取舒腦欣滴丸5粒，6份，按上述樣品溶液處理方法制備成供試品溶液6份，各加入阿魏酸儲(chǔ)備液(200 μg·mL-1)0.5 mL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算阿魏酸平均回收率為97.34%，RSD為1.00%，說(shuō)明本方法回收率良好。

2.3.6超濾膜回收率考察試驗(yàn) 取阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成濃度為6、10、30 μg·mL-1的阿魏酸對(duì)照品溶液；分別吸取上述稀釋后阿魏酸對(duì)照品溶液各0.5 mL，置于超濾管內(nèi)，在4℃下，10000 r/min，離心25 min，即得三種不同質(zhì)量濃度的阿魏酸對(duì)照品的超濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算阿魏酸的濃度，結(jié)果求得超濾膜回收率均大于95%，RSD均小于3%，表明超濾膜對(duì)阿魏酸無(wú)特異性吸附。

2.4 樣品含量測(cè)定

取舒腦欣滴丸藥品5粒，精密稱(chēng)重，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液3份，在上述色譜條件測(cè)定， 計(jì)算舒腦欣滴丸中阿魏酸的含量，得出阿魏酸的平均含量為161.02 μg/丸，RSD<1%。

2.5 蛋白結(jié)合率試驗(yàn)

精密量取舒腦欣滴丸樣品溶液(80.51 μg·mL-1)100 μL，3份，分別置于1.5 mL的離心管中，分別加入900 μL的人血清白蛋白溶液，渦旋1 min混勻，制備成舒腦欣滴丸血清白蛋白樣品溶液。將上述舒腦欣滴丸血清白蛋白溶液于37℃下水浴100 min，吸取0.5 mL置于超濾管中，在4℃，10000 r/min離心25 min，取其超濾液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄阿魏酸峰面積，計(jì)算舒腦欣滴丸中阿魏酸的血漿蛋白結(jié)合率為(20.92±1.33)%，計(jì)算公式如下：血漿蛋白結(jié)合率=(ρ超濾前-ρ超濾液)/ρ超濾前×100%，式中：ρ超濾前為超濾前舒腦欣滴丸中阿魏酸的質(zhì)量濃度，ρ超濾液為舒腦欣滴丸超濾液中阿魏酸的質(zhì)量濃度。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)對(duì)舒腦欣滴丸中阿魏酸的提取溶劑、超聲時(shí)間、溶劑濃度進(jìn)行了篩選，分別考察了50%、70%、90%甲醇和乙醇超聲提取，超聲時(shí)間20 min、40 min、60 min，結(jié)果70%甲醇超聲提取40 min為最佳提取條件。

血液中的游離型藥物是產(chǎn)生藥理作用的部分，也唯有游離的藥物才能被生物轉(zhuǎn)化或腎臟排泄，藥物與蛋白的結(jié)合會(huì)影響藥物的作用持續(xù)時(shí)間。通常與藥物結(jié)合的血漿蛋白主要是白蛋白、脂蛋白及α1-酸性糖蛋白，因?yàn)榘椎鞍椎暮孔罡撸虼诉x擇人血清白蛋白進(jìn)行研究。研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的方法有很多，傳統(tǒng)的方法如超濾法、平衡透析法、微透析法和凝膠過(guò)濾法等[8]，其中平衡透析法和超濾法比較常用，但是平衡透析法耗時(shí)比較長(zhǎng)，透析袋可能存在特異性吸附，使測(cè)定的藥物蛋白結(jié)合率產(chǎn)生較大的誤差。而超濾法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離速度快，并且樣品用量少，避免藥品的浪費(fèi)，因此本實(shí)驗(yàn)采用超濾法測(cè)定舒腦欣滴丸中阿魏酸的血漿蛋白結(jié)合率[9]。

本次試驗(yàn)對(duì)離心時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速及溫育時(shí)間進(jìn)行了考察。分別以5000、8000、10000 r/min的轉(zhuǎn)速下分別離心15、25、30 min時(shí)，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算阿魏酸濃度變化情況，超濾管中超濾液體積的變化情況，根據(jù)不漏蛋白，并且超濾液體積與總體積之比在0.3到0.6之間的標(biāo)準(zhǔn)[9]，確定超濾條件為10000 r/min，25 min。溫育時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響藥物的血漿蛋白結(jié)合率，時(shí)間過(guò)短則藥物與蛋白的結(jié)合不完全?？疾鞙赜龝r(shí)間時(shí)，模擬人體溫度，分別將阿魏酸與人血清白蛋白溫育30、60、80、100、120、150 min，取出處理進(jìn)樣測(cè)定，發(fā)現(xiàn)100 min后阿魏酸濃度幾乎不發(fā)生變化，說(shuō)明阿魏酸與人血清白蛋白結(jié)合已經(jīng)達(dá)到平衡，所以溫育時(shí)間為100 min。