李 曼，劉春麗，毛紅梅，徐淑琴

多囊卵巢（PCOS）屬內(nèi)分泌紊亂綜合征，臨床多伴隨卵巢多囊樣改變、稀發(fā)排卵或不排卵、胰島素抵抗（IR）等癥狀[1]。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，多認(rèn)為IR參與其發(fā)病過(guò)程[2]。PI3K途徑是與細(xì)胞內(nèi)糖代謝密切相關(guān)的信號(hào)通路，PI3K信號(hào)磷酸化減少為PCOS出現(xiàn)IR的重要特征。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利拉魯肽可通過(guò)降低PI3K抑制劑對(duì)PI3K通路的抑制影響，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[3]。但目前對(duì)利拉魯肽對(duì)PCOS的治療作用了解尚少，對(duì)其確切作用機(jī)制及對(duì)PI3K通路的影響尚未完全明確。基于此，本研究建立PCOS大鼠模型，并給予利拉魯肽干預(yù)，旨在研究利拉魯肽對(duì)PI3K信號(hào)通路的影響及其調(diào)節(jié)PCOS大鼠生殖內(nèi)分泌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的清潔級(jí)SD雌性大鼠[SCXK(鄂)2013-0016]，體質(zhì)量190～210 g，自由攝食、水，自然光照，室溫 23 ℃，光照周期12 h明/12 h暗，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2 主要試劑與儀器 利拉魯肽注射液（丹麥Novo Nordisk A/S 公司），DHEA（美國(guó) IL 公司）；Western blot試劑盒（Fermentas公司），RT-PCR 試劑盒（ToYoBo公司），Trizol試劑盒、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，P、T、E2酶聯(lián)免疫試劑盒（Invitrogen公司）；Light Cycler480型RT-PCR儀，Imark全自動(dòng)酶標(biāo)儀（基因有限公司）。

1.3 分組、建模及給藥方法 將30只SD健康雌性大鼠隨機(jī)分為參照組、模型組與干預(yù)組，各10只。除參照組外，均采用DHEA法建立PCOS大鼠模型[6]：每日自大鼠頸背部皮下注射DHEA 600 mg/100 g，連續(xù)21 d，見(jiàn)大鼠體重增加，陰道涂片動(dòng)情周期消失，血清雄激素、黃體生成素升高，卵巢體積增大，卵巢組織呈多囊樣改變，為造模成功[7]。干預(yù)組在造模成功后，自頸背部皮下注射利拉魯肽0.4 mg/kg，1次/d；參照組和模型組注射同等量生理鹽水，兩組均持續(xù)給藥16 w。期間所有大鼠正常攝食飲水。

1.4 標(biāo)本采集 干預(yù)結(jié)束后，各組均空腹10 h，次日清晨采用10%水合氯醛麻醉大鼠，快速心臟取血，離心后低溫冷藏備用；取雙側(cè)卵巢組織，右側(cè)卵巢采用多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，行HE染色及免疫組化觀察；左側(cè)卵巢組織用無(wú)菌生理鹽水沖洗，冷凍儲(chǔ)存，備用。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 卵巢組織形態(tài)學(xué) 對(duì)卵巢組織切片后進(jìn)行染色，鏡下觀察卵巢組織形態(tài)變化。

1.5.2 激素和血糖 以酶聯(lián)免疫法測(cè)定大鼠血清孕激素（P）、睪酮（T）水平，以氧化酶法測(cè)定空腹血糖（FPG）水平。

1.5.3 卵巢組織PI3K mRNA 提取大鼠卵巢組織總RNA，進(jìn)行純度、濃度鑒定，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，采用RT-PCR法測(cè)定卵巢組織PI3K mRNA水平。

1.5.4 卵巢組織PI3K信號(hào)通路各分子蛋白表達(dá)水平 以Western blot法測(cè)定卵巢組織PI3K信號(hào)通路相關(guān)分子AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平。取冰凍卵巢組織，解凍研磨，充分裂解，12 000 r/min離心10 min，獲取蛋白提取液；加蛋白上樣液，凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉；加一抗孵育過(guò)夜，洗膜，加過(guò)氧化物標(biāo)記二抗，孵育60 min，洗膜3次×5 min，X光片顯影，計(jì)算機(jī)攝像，采用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析條帶，以目的條帶、內(nèi)參條帶光密度比值為蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，多組比較行方差分析，組內(nèi)比較進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠卵巢組織形態(tài)觀察 參照組卵巢組織切片HE染色見(jiàn)不同發(fā)育階段卵泡，見(jiàn)多個(gè)黃體，顆粒細(xì)胞層約為8～9層，且細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊、緊密，卵泡膜細(xì)胞層薄，為1～2層（圖1a）；模型組卵巢結(jié)構(gòu)紊亂，近包膜下見(jiàn)多個(gè)囊性擴(kuò)張卵泡，部分卵泡內(nèi)無(wú)卵母細(xì)胞，且放射冠消失，可見(jiàn)顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，少見(jiàn)黃體（圖1b）；干預(yù)組顆粒細(xì)胞層較模型組增多，卵泡膜細(xì)胞層變薄，見(jiàn)成熟卵泡，黃體數(shù)量較模型組多（圖1c）。

2.2 各組激素和血糖水平比較 參照組與干預(yù)組血清P和FPG水平比較無(wú)顯著差異，且均與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）；3組血清T水平大小順序?yàn)閰⒄战M＜干預(yù)組＜模型組（P＜0.05，表1）。

表1 各組激素和血糖水平比較（n=10）

圖1 各組卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE×100）

2.3 各組卵巢組織PI3K mRNA水平比較 模型組PI3K mRNA、AKT蛋白、p-AKT蛋白表達(dá)水平低于參照組與干預(yù)組（P＜0.05）；干預(yù)組僅PI3K mRNA表達(dá)水平高于參照組 （P＜0.05），而AKT蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)水平與參照組相近（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組卵巢組織Pl3KmRNA表達(dá)和AKT及p-AKT蛋白表達(dá)水平比較（n=10）

3 討論

PCOS患者不僅生殖功能異常，且伴有糖耐量降低、糖脂代謝異常等內(nèi)分泌代謝紊亂表現(xiàn)，遠(yuǎn)期易出現(xiàn)IR、糖尿病及心血管疾病[4]。研究認(rèn)為，PCOS患者普遍存在選擇性IR，主要體現(xiàn)在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、信號(hào)通路代謝途徑缺陷等[5]。

PI3K是具備特異性催化磷脂酰肌醇脂物質(zhì)的激酶類型，有脂類激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，可被絡(luò)氨酸與非絡(luò)氨酸激酶受體等細(xì)胞因子受體活化[6]。PI3K信號(hào)通路是與細(xì)胞內(nèi)糖代謝調(diào)節(jié)緊密關(guān)聯(lián)的信號(hào)途徑，而PI3K途徑磷酸化減少則為PCOS胰島素抵抗的主要表現(xiàn)，可直接導(dǎo)致信號(hào)通路中斷，引起與染色體遺傳物質(zhì)變異相關(guān)疾病，直接影響人體生理功能及發(fā)育進(jìn)程[7]。本研究采用DHEA法建立PCOS大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與參照組比較，PCOS模型組卵巢組織PI3K mRNA表達(dá)水平明顯降低，且與PI3K信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-AKT表達(dá)水平也降低，表明PCOS大鼠存在明顯胰島素PI3K信號(hào)通路異常表現(xiàn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組P水平較參照組更低，而T、FPG水平較參照組更高，證實(shí)PI3K信號(hào)通路異常與PCOS卵巢激素合成存在密切聯(lián)系，該通路信號(hào)磷酸化異常是導(dǎo)致PCOS并發(fā)高雄激素血癥的重要原因，且PCOS胰島素抵抗與高雄激素血癥形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步影響其卵巢功能[8]。因此，必須重視改善其IR，實(shí)現(xiàn)促排卵。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）則為進(jìn)食后遠(yuǎn)端腸腔L型細(xì)胞所分泌的腸促胰素，其與GLP-1受體結(jié)合后可降低胰高糖素分泌，刺激迷走神經(jīng)，控制食欲及飽腹感，延遲胃排空，降低體重，早期被證實(shí)在2型糖尿?。═2DM）治療中有肯定的效果[9]。利拉魯肽則為臨床常用GLP-1類似物，可有效降低T2DM患者FPG、餐后2 h血糖及糖化血紅蛋白，同時(shí)改善患者胰島β細(xì)胞功能，且減重效果明顯。

本研究還發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組顆粒細(xì)胞層增多，成熟卵泡、黃體數(shù)量較模型組多，考慮是因?yàn)槔旊母深A(yù)可通過(guò)激活PI3K通路，調(diào)節(jié)甾體激素合成酶表達(dá)，降低卵巢顆粒細(xì)胞睪酮合成能力，抑制高雄激素血癥，上調(diào)孕激素表達(dá)，促進(jìn)卵泡發(fā)育，同時(shí)抑制胰島β細(xì)胞凋亡，改善胰島細(xì)胞功能，糾正PCOS胰島素抵抗及糖代謝紊亂[10]。

綜上所述，利拉魯肽可通過(guò)激活PI3K信號(hào)通路，調(diào)節(jié)甾體激素合成酶表達(dá)，抑制雄激素表達(dá)，改善PCOS胰島素抵抗，調(diào)節(jié)其糖代謝，促進(jìn)卵泡發(fā)育。