敬 敏，張國平，吳 歡，王 瑜，劉貴平，谷從陽

（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院：1病理科；2肝膽外科，四川內(nèi)江 641000）

我國肝癌的發(fā)病率居世界首位[1]，HCC為主要病理類型，這與我國HBV感染有關。手術治療近期療效確切，但腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴重影響其遠期療效[2]。因此尋找影響HCC 進展的基因及蛋白分子對提升臨床療效十分重要。近年的研究表明腫瘤組織中存在的腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是影響腫瘤形成及侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因[3]。肝癌干細胞(1iver cancer stem cells，LCSCs)是存在于HCC 組織中的CSCs，與HCC 的形成、進展及復發(fā)相關[4-5]。CD133是LCSCs的標記物之一，在HCC組織中高表達，與腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移相關[6]。CD44是另一種LCSCs的表面標記分子，其表達與腫瘤的分期有關,并可影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究通過檢測43例HCC組織中CD133和CD44蛋白的表達，探討其與臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2015年6月至2018年9月經(jīng)本院肝膽外科手術切除并經(jīng)病理確診的43 例HCC 患者的腫瘤組織標本，其中男性24 例、女性19 例、年齡47～75 歲、中位數(shù)年齡61歲。所有患者均有HBV感染背景，行手術切除前未接受腫瘤相關的其他治療。病例隨訪至死亡或截止時間為2018 年9 月，共隨訪3～36 月。入選病例均有完整的臨床及隨訪資料。臨床資料包括年齡、性別、腫瘤直徑、甲胎蛋白量、分化程度、門脈癌栓及臨床分期。收集癌旁組織（距腫瘤距離均＞2 cm）標本36例作為對照。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑

CD133 單克隆抗體（鼠抗人）購自Santa Cruz 公司，CD44 單克隆抗體（鼠抗人）購自北京中杉金橋公司，DAB 顯色試劑盒購自福州邁新生物技術公司。其他所需試劑如蒸餾水、雙氧水等由內(nèi)江市第一人民醫(yī)院病理科提供。

1.2.2 免疫組化

所有標本經(jīng)常規(guī)固定、包埋，4 μm 連續(xù)切片。按試劑說明的操作步驟進行CD133 和CD44 分子的免疫組化檢測。設陽性對照（試劑公司提供的陽性切片）和陰性對照（PBS代替一抗）。

1.3 結(jié)果判定

CD133和CD44蛋白均定位于細胞膜，染色呈棕黃色著色。隨機選擇5 個高倍視野（×40）計算陽性細胞數(shù)所占的百分比。＜30%為弱陽性，30%～60%為陽性，＞60%為強陽性，無陽性細胞為（-）。免疫組化結(jié)果由2 位病理科主治醫(yī)師獨立進行觀察判斷，結(jié)果不一致時共同觀察切片。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料均以±s表示，兩個樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier 方法作生存分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化SP 法觀察CD133 蛋白在HCC 組織中的表達

HCC 中CD133 主要表達于細胞膜，呈棕黃色顆粒著色（圖1），陽性表達率58.1%（25/43），高于在癌旁正常肝組織中的表達19.4%（7/36），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。臨床特征分析提示CD133 蛋白的表達與腫瘤直徑、分化程度及門靜脈癌栓形成有關；臨床分期中Ⅲ+Ⅳ期患者CD133蛋白表達高于Ⅰ+Ⅱ期患者（P＜0.05），但與患者年齡、性別及甲胎蛋白無明顯相關性（P＞0.05），見表2。

表1 CD133蛋白在HCC及癌旁組織中的表達情況

2.2 免疫組化SP 法觀察CD44 蛋白在HCC 組織中的表達

HCC組織中CD44蛋白表達于細胞膜，呈線性棕黃色著色（圖2），陽性表達率69.8%（30/43），高于癌旁肝組織的22.2%（8/36），兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。CD44 蛋白的表達與臨床分期（Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期）及門靜脈癌栓形成有關（P＜0.05），與性別、年齡及甲胎蛋白含量無明顯相關性（P＞0.05）。CD44的表達與腫瘤分化程度及大小無明顯關系，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

圖1 CD133在HCC中的表達（×200）

圖2 CD44在HCC中的表達（×200）

表2 CDl33和CD44蛋白表達與肝癌臨床病理特征的關系

2.3 生存分析

隨訪時間3～36 月，平均25 月。隨訪期間腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移28 例，死亡16 例。采用Kaplan-Meier 方法作生存分析比較3年總體生存率。CD133陽性表達組（40%）低于陰性表達組（72.2%）(P＜0.05），見圖3；CD44蛋白陽性表達組（43.3%）也低于陰性表達組（76.9%）（P＜0.05），見圖4。

表3 CD44蛋白在HCC及癌旁組織中的表達情況

3 討論

HCC是我國肝癌患者的主要病理類型，與HBV感染、肝硬化的序慣性改變有關。手術切除為其主要的治療方式，但術后易復發(fā)、轉(zhuǎn)移，嚴重制約臨床療效的提高[8]。因此尋找肝癌進展的基因及治療靶點對臨床早期診斷及提升治療效果具有重要意義。CSCs是近年該領域的研究熱點，與腫瘤的形成及演變發(fā)展密切相關。

圖3 CD133陽性表達的生存曲線

圖4 CD44陽性表達的生存曲線

CD133 是腫瘤干細胞特征性標志物，定位在人類4號(4p16.12.p1)和2號染色體上，是一種5次跨膜的細胞表面糖蛋白，與腫瘤細胞間存在密切的聯(lián)系[9]。已有的研究提示CD133的表達與多種惡性腫瘤患者的預后具有相關性[10-11]。在肝癌中的研究也表明CD133的表達與肝癌的分化程度及臨床分期呈負相關關系[12]。在本組研究中CD133在HCC組織中的陽性表達為25 例（58.1%），明顯高于癌旁組織7 例（19.4%），兩組間差異有統(tǒng)計學意義。提示CDA133是HCC細胞較特異的表面標志物，并在肝癌的成瘤過程中發(fā)揮作用。通過對臨床病理特征的分析發(fā)現(xiàn)CD133的表達與患者年齡、性別、甲胎蛋白等無明顯相關性；與腫瘤直徑、臨床分期及門脈癌栓形成的有關。提示CD133蛋白的高表達與腫瘤的侵襲性高有關，這與CD133 在其他腫瘤中的研究結(jié)果類似[13]。進一步的生存分析也顯示CD133 陽性組的HCC 患者3 年生存率低于陰性，提示CD133 的表達與HCC患者的生存時間相關。

CD44是另一種LCSCs的表面標記分子，具有介導淋巴細胞歸巢、向炎癥部位侵化及黏附細胞外基質(zhì)等作用[14]。目前較多的研究表明CD44 基因表達的上調(diào)可導致腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移功能的增強，這與CD133在腫瘤組織中的作用具有相似性[15]。本研究應用免疫組化法檢測HCC 和癌旁組織中CD44 蛋白的表達，結(jié)果顯示CD44 蛋白定位于HCC細胞膜，呈線性棕黃色著色，其陽性細胞呈分散或簇狀分布在肝癌組織中。在43例HCC組織中CD44表達陽性為30 例（69.8%），高于癌旁組織8 例（22.2%），兩組差異有統(tǒng)計學意義，提示CD44 是HCC 細胞較特異的表面標志物，并在肝癌的成瘤過程中發(fā)揮作用。臨床特征分析提示CD44 的陽性表達與HCC 的臨床分期及門脈癌栓形成有關。生存分析結(jié)果顯示CD44 陽性組患者3 年總體生存率低于陰性組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義，這與CD44 在消化系統(tǒng)的其他腫瘤中的研究結(jié)果類似[16]。

4 結(jié)論

表達CD133 和CD44 蛋白肝癌干細胞與肝癌的形成及其侵襲轉(zhuǎn)移密切相關，推測其可能參在肝癌成瘤、侵襲及轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。通過檢測CD133 和CD44 蛋白的表達可為肝癌生物學行為提供新的判斷指標，但其影響肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體作用機制還有待進一步研究。