張?jiān)凭?，劉洪?/p>

（1.福建省浦城縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，福建浦城 353400；2.煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)，山東煙臺(tái) 264000）

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是指一類能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的無芽胞、革蘭染色陽性細(xì)菌的總稱，是應(yīng)用最早的一種益生菌，已被廣泛添加于各種動(dòng)物的飼料中。目前，市場(chǎng)上大部分乳酸桿菌菌株是從人和哺乳動(dòng)物腸道中或土壤中分離到的[1]。由于乳酸菌的益生作用具有宿主特異性，即分離自同一動(dòng)物腸道的菌類，一般只在本類動(dòng)物腸道定殖發(fā)揮作用效果更好。為了尋找一種能夠應(yīng)用于豬的益生菌，本研究從豬小腸中分離豬源乳酸菌，并對(duì)分離的1株乳桿菌進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定，為下一步乳酸菌益生效果的評(píng)價(jià)提供菌種來源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

采取昆明某屠宰場(chǎng)豬消化道全套樣品，無菌采取樣品于無菌容器內(nèi)，立即送檢。

1.2 菌株的分離與初步鑒定篩選

將小腸樣品去除糞便，無菌剪開用生理鹽水沖洗，再用生理鹽水將樣品依次進(jìn)行10，102，103，104，105，106稀釋，取 1mL 稀釋液傾注培養(yǎng)于加碳酸鈣MRS培養(yǎng)基內(nèi)，各稀釋度傾注2個(gè)瓶皿，分別在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48h。挑取單個(gè)有典型溶鈣圈的菌落，MRS平板劃線傳代，純培養(yǎng)[2]。

1.3 乳酸菌生理生化鑒定

根據(jù)革蘭氏染色鏡檢，參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[2]及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和第九版[3，4]，對(duì)該株乳酸菌進(jìn)行以下生化鑒定實(shí)驗(yàn)。

1.4 乳酸菌16SrDNA基因測(cè)序及同源性分析

首先通過MRS液體培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照BIOTEKE公司細(xì)菌DNA提取試劑盒(DP2001)說明，提取乳酸菌的總DNA。利用提取的細(xì)菌全基因組DNA作為模板，進(jìn)行16sDNA PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物，封口膜封口后，送大連寶生物（TaKaRa）公司進(jìn)行測(cè)序。利用Blast，Clustal，DNAman，MEGA 等生物軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank下載的菌株16sDNA序列進(jìn)化樹構(gòu)建并進(jìn)行同源性分析。同源性達(dá)到97.5%認(rèn)為是一個(gè)種或亞種。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 分離菌株的菌落特性結(jié)果

該株純菌種接種到加CaCO3 MRS平板，該菌株菌落特性有溶鈣圈，菌落形態(tài)呈大小不一，白色圓形，邊緣光滑，濕潤(rùn)有光澤的菌落特征。見圖1。

圖1 LP1乳桿菌菌落特征圖

2.2 分離菌株的染色形態(tài)特性結(jié)果

將該株乳桿菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，1000倍光鏡下該株乳桿菌為無鞭毛，無莢膜，無芽孢的藍(lán)紫色革蘭氏陽性桿菌。見圖2。

圖2 LP1乳桿菌染色特征圖

2.3 分離的該菌株的生理生化特性結(jié)果

將該株乳桿菌進(jìn)行屬的生化試驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)性（-）、過氧化氫酶（-）、吲哚（-）、明膠液化（-）、硫化氫（-）、硝酸鹽還原（-）、pH4.5 MRS 生長(zhǎng)（+），種的生化特性全為陰性。參考《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》和《伯杰氏鑒定手冊(cè)》，初步判斷LP1為乳桿菌屬，基本推斷LP1為格氏乳桿菌。

2.4 同源性比對(duì)結(jié)果

16s-rRNA擴(kuò)增的DNA送大連寶生物(TaKaRa)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的豬源乳桿菌用Blast、Clustal、MEGA 和 DNAstar 等生物軟 件分析，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（見圖3），由遺傳進(jìn)化樹可知，LP1與 L.gasseri（格氏乳桿菌）在同一分支上，說明LP1與L.gasseri的親緣性最近。根據(jù)進(jìn)化樹的親緣性關(guān)系選擇處在同一大枝上的11條序列進(jìn)行同源性比對(duì)（見圖4），由同源性比對(duì)圖可知，LP1與格氏乳桿菌的同源性為98.7%。表型鑒定結(jié)果與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致，即LP1為格氏乳桿菌。

圖3 LP1乳桿菌的進(jìn)化樹

圖4 LP1乳桿菌的同源性圖

3 討論

益生菌的菌株具有較強(qiáng)的針對(duì)性和特異性，在其被制作成活菌制劑后也有一定的專一性，因此本研究直接從健康的豬腸道中進(jìn)行乳酸桿菌的分離。

(1)益生素具有無污染、無藥物殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，符合可持續(xù)發(fā)展的要求。乳酸桿菌制劑作為一種益生素，可通過生物拮抗、改善動(dòng)物腸道的生態(tài)環(huán)境及提高動(dòng)物免疫力等機(jī)制發(fā)揮其益生素的作用，已被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中[5]。

(2)乳酸桿菌微生態(tài)制劑作為一種優(yōu)質(zhì)的環(huán)保生態(tài)產(chǎn)品，應(yīng)用前景廣闊[6]。

不同種動(dòng)物宿主來源的益生菌對(duì)動(dòng)物腸道上皮的粘附性是不同的，影響微生態(tài)制劑的使用效果。益生菌的粘附性好壞也是決定益生素質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一[7]。家畜微生態(tài)制劑使用的菌種最好為經(jīng)鑒定的具有優(yōu)良粘附性的源自家畜的益生菌。此次試驗(yàn)分離到乳酸菌可進(jìn)一步為乳酸菌益生效果研究提供菌種來源，從而為微生態(tài)制劑的制備篩選優(yōu)良菌種。