楊秀娟， 陶琳麗， 鄧 斌， 曹志勇， 黃 偉， 陶 冶， 戚 敏， 張 曦*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南昆明650201；3.云南省農(nóng)村科技服務中心，云南昆明650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學基礎與信息工程學院，云南昆明650201；5.云南省飼料工業(yè)協(xié)會，云南昆明650201）

蛋白質是維持機體生命活動所必需的營養(yǎng)物質，傳統(tǒng)的蛋白質代謝模式認為蛋白質必須水解成游離氨基酸后通過氨基酸轉運載體吸收入機體后被動物體吸收利用。然而，研究發(fā)現(xiàn)含2個或3個氨基酸的小肽是蛋白質水解的主要產(chǎn)物（Adibi，1973），并且其可以通過載體直接被吸收。許多試驗證明，蛋白質在降解為氨基酸的過程中產(chǎn)生的中間體小肽可被動物體直接吸收（Agar，1953）。小肽能在腸道轉運載體協(xié)助下直接被完整的吸收，具有吸收速度快、載體不易飽和、耗能低且效率高的特點，而且以小肽形式供給氨基酸可以避免游離氨基酸因競爭結合位點而造成的抑制效應，從而促進蛋白質飼料的吸收及轉化（Gilbert，2008；Hara，1984）。本試驗以雞肉為原料，探索鹽酸水解方法制備2～3個氨基酸組成的雞肉小肽產(chǎn)品的工藝條件，并通過正交試驗以期獲得最優(yōu)水解工藝條件，為雞肉深加工利用研制出一種營養(yǎng)豐富，安全可靠的小肽產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 雞肉，購至市場，切碎用攪拌機進行攪碎后供水解使用。

1.1.2 試驗儀器 全自動凱氏定氮儀（SKD-1000），上海沛歐分析儀器有限公司；pH計（pHS-3D），上海精密科學儀器有限公司。

1.1.3 試劑 中性甲醛溶液（36%），應不含有聚合物，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH為7.0；0.1 mol/L硫酸標準滴定溶液；0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗采用正交試驗設計，在110℃的溫度下分別對水解時間（4、6、8 h）、鹽酸濃度（2、4、6 mol/L）、料液比（1∶2、1∶3、1∶4）3個因素3個水平的正交試驗設計，共9組，見表1。以肽鏈長度為指標確定雞肉小肽的最佳水解工藝參數(shù)。

1.2.2 樣品制備 ?。?.50±0.0001）g雞肉于水解管中，按表1中添加不同濃度、不同體積的酸溶液，抽真空后用噴燈將水解管管口封嚴，置于（110±1）℃烘箱中水解不同的時間。取出水解管，待其冷卻后切開，用定性濾紙過濾至25 mL容量瓶內，定容至刻度。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 總氨基態(tài)氮的測定 采用甲醛滴定法進行測定，吸取5 mL水解液，加50 mL水，置于100 mL燒杯中開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液（0.05 mol/L）滴定至酸度計指示pH 8.2，加入10.0 mL中性甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標準溶液（0.05 mol/L）繼續(xù)滴定至pH 9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液（0.05 mol/L)的毫升數(shù)。試樣中總氨基態(tài)氮的含量按下式進行計算（陳鈞輝等，2008）。

表1 正交試驗設計表L9（33）

式中：X為試樣中總氨基態(tài)氮的含量，mg/g；V1為測定試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V2為空白試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V3為試樣取用量，mL；V4為水解液定容體積，mL；m為雞肉樣品重量，g；c為氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；0.014為與1.00 mL氫氧化鈉標準滴定溶液（1.00 mol/L）相當?shù)牡馁|量，g。

1.3.2 總氮含量的測定 采用全量凱氏定氮法，吸取5 mL水解液到消化管底部（不要黏在管壁內），加入0.4 g無水硫酸銅、6 g無水硫酸鉀和10 mL濃硫酸，置于消化爐上加熱，消化到顏色由淡黃色變成透明的藍綠色并無黑色雜質時停止消化，待消化管在消化爐中冷卻到室溫時，取下消化管并加入少量的蒸餾水（農(nóng)業(yè)部人事勞動司，2008），上機待測。

原料中的總氮含量計算公式如下：

式中：X為試樣中總氮含量，mg/g；V1為滴定試樣時所消耗的硫酸體積，mL；V2為滴定空白試樣時所消耗的硫酸體積，mL；V3為試樣取用量，mL；V4為水解液定容體積，mL；m為雞肉樣品重量，g；c為硫酸標準滴定溶液的濃度，mol/L；0.014為與1.00 mL硫酸標準滴定溶液（1.00 mol/L）相當?shù)牡馁|量，g。

每個容量瓶做2個平行測定，以其算數(shù)平均值為結果。

1.3.3 氮水解回收率的計算 氮回收率是指蛋白質在水解過程中氮的損失程度，計算公式為：

式中：N1為凱氏定氮法測定的水解液中的氮含量，g/mL；V為水解液的總體積，mL；N2為凱氏定氮法測定雞肉中的氮含量，g/g；m為雞肉樣品的質量，g。

1.3.4 水解度的計算公式（楊文博，2014）

式中：總氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法進行測定；總氮含量采用凱氏定氮法進行測定。

1.3.5 平均肽鏈長度的估計（Adler-Nissen，1986）

APL≈1/DH×100%。

設定APL為水解后可得到的多肽的平均鏈長。本試驗擬制備2～3個氨基酸殘基的雞肉小肽，2～3個氨基酸殘基的雞肉小肽的平均肽鏈長應為2～3，因此選定水解度為33%～50%時能滿足雞肉小肽的要求。

1.3.6 肽分子平均相對分子質量（Suh，2000）（PMW） PMW計算公式如下：

PMW=平均肽鏈長度×氨基酸平均相對分子質量；

式中：氨基酸平均相對分子質量為120。

2 結果與分析

2.1 不同水解條件對雞肉氮水解回收率與水解度的影響 由表2可知，不同水解條件對各理組間的氮水解回收率、氨基態(tài)氮、總氮和水解度有顯著的影響（P＜0.05）。從氮水解回收率來看，組1、組4的氮水解回收率比較低，顯著低于其余7個組的氮水解回收率 （P＜0.05），較組3顯著降低33.04%、33.66%（P＜0.05）。

從水解度來看，水解條件對組3、組5、組6、組8與組9的水解度影響不大（P＞0.05），但與組1的水解度相比分別顯著提高29.2%、27.4%、24.9%、30.94%、33.48%（P＜0.05）；水解條件對組2與組4間的以及組2與組7間的水解度沒有顯著影響（P＞0.05），但與組1的水解度相比分別顯著提高13.8%、8.25%、17.3%（P＜0.05）。

2.2 不同水解條件對雞肉小肽平均肽鏈長度和小肽平均分子量的影響 由表3可知，水解條件對各試驗組間平均肽鏈長度（APL）、PMW兩個指標都有顯著的影響（P＜0.05），組1的平均肽鏈長度、肽分子平均相對質量顯著高于其余組（P＜0.05），而組4的平均肽鏈長度、肽分子平均相對質量顯著低于其余組（P＜0.05）。水解條件對組3、組6、組8、組9間平均肽鏈長度、肽分子平均相對質量影響顯著（P＜0.05），與組1相比平均肽鏈長度分別減少1.34、1.4、1.38、1.56，肽分子質量減少159.83、146.08、164.67、171.98。水解條件對組2、組7間平均肽鏈長度、肽分子平均相對質量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.3 不同水解條件對水解效果的主效應分析為比較不同水解條件對總氨、總氨基態(tài)氮含量、氮水解回收率、水解度等因素影響的主次順序，采用極差方法，以極差值大小確定各因素的影響主次順序，結果見表4。

表2 不同水解工藝水解結果比較分析

表3 雞肉小肽平均肽鏈長度和小肽平均分子量比較分析

表4 不同水解條件對水解效果指標的主效應分析表

從表4看出，水解時間、鹽酸濃度、料液比3個水解條件對氮水解回收率、總氮兩個指標的影響主效應是一樣的，即鹽酸濃度＞料液比＞時間，水解時間、鹽酸濃度、料液比3個水解條件對氨基態(tài)氮、水解度、平均肽鏈長度、肽分子平均相對分子質量4個指標的影響主效應也是一樣的，即鹽酸濃度＞時間＞料液比。

為了更直觀的反映水解條件對試驗指標的影響規(guī)律和趨勢，以水解條件為橫坐標，以試驗指標的平均值為縱坐標，繪制指標的趨勢圖（圖1～圖6）。

圖1 水解條件對總氮的影響趨勢圖

圖2 水解條件對氨基態(tài)氮的影響趨勢圖

圖3 水解條件對水解度的影響趨勢圖

圖4 水解條件對氮回收率的影響趨勢圖

圖5 水解條件對平均肽鏈長度的影響趨勢

圖6 水解條件對肽平均分子量的影響趨勢圖

從圖1～圖6中可以看出，水解時間、鹽酸濃度、料液比3個水解條件對總氮、氨基態(tài)氮、水解度、氮回收率的影響趨勢是相同的，即隨著水解時間的延長、鹽酸濃度、料液比的增加，總氮、氨基態(tài)氮、水解度、氮回收率也隨著增加；而平均肽鏈長度、肽平均分子質量則逐漸減小，說明隨著水解條件的變化，蛋白質逐漸被水解為不同肽鏈長度的小肽，底物蛋白質分解增多，但是蛋白質分解成的肽也進一步降解為氨基酸，從而肽含量增加程度減小。

3 討論

研究中設計的水解時間、鹽酸濃度和料液比3個水解條件中，鹽酸濃度是影響試驗指標的主要因素。這是由于溶液中氫離子濃度越高，則蛋白質肽鍵被切斷的可能性越大，酸量的增加必然提高了酸對蛋白質的作用能力（馬永全等，2010）。馬永全等（2010）采用酸法水解河蜆蛋白質，以水解度為指標，通過對鹽酸、檸檬酸、乳酸的單因素試驗，確定選用5%鹽酸可獲得較好的水解效果，通過鹽酸的優(yōu)化正交試驗，選擇水解時間、溫度、鹽酸用量、料液比4因素3水平的正交設計，得到河蜆蛋白質酸水解的最佳條件為：鹽酸用量5.5%，溫度100℃，水解時間9 h，料液比1∶3，河蜆蛋白質水解度達到59.34%，鹽酸水解河蜆蛋白質時，蛋白質水解度隨著鹽酸用量的增加而呈上升趨勢，與本試驗獲得的趨勢一致。方富永等（2009）利用6 mol/L的HCl溶液對波紋巴非蛤肉進行水解發(fā)現(xiàn)，波紋巴非蛤肉中氨基酸含量豐富，包括人體必需的7種氨基酸。而且，鮮味氨基酸豐富，可用于制作營養(yǎng)豐富的氨基酸口服液或高級調味料。陳曉剛等（2011）采用響應面分析法對酸水解制備波紋巴非蛤小分子肽工藝進行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)酸水解條件為：固液質量比1∶3、鹽酸濃度6.4 mol/L、酸水解溫度92℃、酸水解時間5.3 h，在此條件下肽得率為82.21%，與鹽酸濃度固定為6 mol／L的條件下，隨著酸水解溫度的升高，肽得率呈先上升后下降的趨勢，主要是因為溫度過高，小分子肽開始大量地進一步分解為游離氨基酸，導致肽得率下降。喬偉等（2006）用6 mol/L的鹽酸水解大豆分離蛋白質，得到適宜的水解條件為溫度90℃，水解時間5 h，終產(chǎn)物中二肽和三肽含量為19.38%。李培駿等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，水解度控制是水解過程的關鍵，預制備含3～8個氨基酸殘基的小肽水解物，即水解度控制在10.0%～34.0%。鄧勇等（2001）利用葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）柱層析和高壓液相色譜（HPLC）測定大豆多肽分子質量與水解度的關系，隨著大豆蛋白質水解度的增加，大豆多肽混合物的分子質量變小，用水解度估算的大豆多肽混合物分子質量與理論計算相符，進一步驗證了利用水解度判斷肽分子質量的可行性。本試驗所得水解產(chǎn)物中因含有大量的酸，若能去除其中的酸，則可提高水解物中的肽含量，提高實際的應用效果。

4 結論

鹽酸濃度是決定水解效果的主要因素，水解2～3個氨基酸為主的雞肉小肽的最優(yōu)水解工藝條件為：鹽酸濃度4mol/L，料液比1∶3，水解時間4h。在最優(yōu)工藝條件下，雞肉中的氮水解回收率為81.79%。