楊 華 吳 卓 李春苑 陳自洪 鄒 彥 鄧志華 韋永全 曾建偉 廖維芳 譚慶英 梁新紅 黃柳靜 丘 映 許常龍

(南寧市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西南寧市 530031，電子郵箱：85308539@qq.com)

【提要】 胚胎植入前基因篩查和植入前遺傳學(xué)診斷能夠幫助檢測(cè)胚胎的整倍性，并檢測(cè)其是否攜帶遺傳病致病基因，從而篩選出更為健康的胚胎以提高妊娠率。將早期的活檢技術(shù)結(jié)合近些年研發(fā)出的新一代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，使得胚胎植入前基因檢測(cè)技術(shù)具有更高的精確度以及更優(yōu)的時(shí)效性。本文針對(duì)胚胎植入前基因檢測(cè)技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并從社會(huì)和人文角度對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行展望和思考。

在我國(guó)，由出生缺陷問題所導(dǎo)致的圍產(chǎn)兒和嬰兒死亡的現(xiàn)象較為常見，即便患兒能夠存活，由缺陷帶來(lái)的殘疾和其他問題也嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量，給家庭成員帶來(lái)巨大的心理負(fù)擔(dān)和精神壓力。單基因遺傳病是造成新生兒出生缺陷的主要疾病之一，指由基因組DNA上一個(gè)或一對(duì)等位基因突變所導(dǎo)致且符合孟德爾遺傳規(guī)律的疾病，包括顯性遺傳、隱性遺傳及X-連鎖遺傳等多種遺傳類型。雖然單基因遺傳病的單個(gè)病種發(fā)病率較低，但由于其病種繁多，所以在出生活嬰中的總體發(fā)病率和人群中的總體患病率很高[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)還不能改變已出生者的基因，絕大多數(shù)遺傳病無(wú)法治愈，而且患者的致病基因會(huì)傳遞給子孫后代，解決這一問題的根本途徑是進(jìn)行出生前或胚胎移植前診斷，從而避免此類患兒出生。

胚胎植入前基因檢測(cè)可以在胚胎移植入子宮之前，將其中的部分細(xì)胞取出進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷或植入前遺傳學(xué)篩查。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷能夠較好地對(duì)已知缺陷進(jìn)行檢測(cè)，例如當(dāng)父母一方攜帶有突變位點(diǎn)或基因重組時(shí)，能夠檢測(cè)到胚胎的特定位點(diǎn)突變或染色體重排；而胚胎植入前遺傳學(xué)篩查則更廣泛地應(yīng)用于篩查染色體非整倍體現(xiàn)象，特別是高齡產(chǎn)婦以及習(xí)慣性流產(chǎn)患者。本文針對(duì)胚胎植入前基因檢測(cè)的現(xiàn)行技術(shù)及新技術(shù)進(jìn)行綜述，并從社會(huì)和人文角度對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行展望和思考。

1 植入前基因檢測(cè)的概述

自1978年首例應(yīng)用體外受精技術(shù)的嬰兒出生以來(lái)，為了不斷提高受孕率，人們開發(fā)出各種輔助生殖技術(shù)，如胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)以及胚胎低溫保存技術(shù)等[2]。早期胚胎著床率和早孕率下降的主要原因是非整倍體比例的升高，研究表明，妊娠前3個(gè)月的流產(chǎn)中，非整倍體原因所致流產(chǎn)占50%[3]。因此，直接將整倍體胚胎移植入子宮能顯著提高著床率并降低流產(chǎn)率，植入前基因檢測(cè)應(yīng)運(yùn)而生。

植入前基因檢測(cè)的受試者通常是經(jīng)過檢查后，有可能生育單基因缺陷風(fēng)險(xiǎn)嬰兒的夫婦。植入前遺傳學(xué)診斷通常對(duì)經(jīng)由體外受精獲得的胚胎進(jìn)行活檢，對(duì)胚胎中1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析，并最終選擇未受基因缺陷影響的胚胎進(jìn)行移植。極體是卵母細(xì)胞兩次減數(shù)分裂的副產(chǎn)物，其中包含著多余的母源染色體，因此可通過極體對(duì)母源單基因遺傳缺陷進(jìn)行檢測(cè)。伴隨著胚胎發(fā)育，還可以從卵裂階段的胚胎到囊胚階段的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中取出1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活檢。而成熟的胚胎玻璃化冷凍和快速解凍技術(shù)，不僅能夠保證胚胎后續(xù)發(fā)育不受影響，還能對(duì)胚胎進(jìn)行遺傳診斷和篩查，使得囊胚期胚胎活檢成為較為可靠的植入前基因檢測(cè)手段。

有研究者將植入前基因檢測(cè)細(xì)分為用于單基因疾病的胚胎植入前基因檢測(cè)(用于染色體非整倍體的胚胎植入前基因檢測(cè))和用于染色體結(jié)構(gòu)失衡的胚胎植入前基因檢測(cè)[4]，這使得植入前基因檢測(cè)的研究方向更為細(xì)致和深入。此外，植入前基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也離不開微量DNA遺傳和染色體分析技術(shù)發(fā)展，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，熒光原位雜交(flourescence in situ hybridization,FISH)，以及包括單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridisation,aCGH)以及“下一代”測(cè)序術(shù)(next-generation sequencing，NGS)等在內(nèi)的微陣列技術(shù)。眾多分子生物學(xué)方法論的發(fā)展也推動(dòng)著植入前基因檢測(cè)技術(shù)的快速成熟和穩(wěn)定，使得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度不斷提高，檢測(cè)范圍和檢測(cè)深度也邁上新的階梯。

2 現(xiàn)行植入前基因檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及劣勢(shì)

2.1 極體活檢 極體活檢是指在胚胎卵裂前取出第1次及第2次減數(shù)分裂所排出的極體，并進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。1990年，學(xué)界首次報(bào)道了臨床應(yīng)用極體活檢技術(shù)對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行評(píng)估，并且該項(xiàng)技術(shù)對(duì)后續(xù)的著床率和卵裂期的胚胎發(fā)育無(wú)負(fù)面影響[5]。極體活檢通過取出極體對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行預(yù)測(cè)和評(píng)估，避免了從胚胎中取出細(xì)胞，具有一定的優(yōu)勢(shì)。但由于該技術(shù)僅能分析母源染色體或基因，而無(wú)法對(duì)父源遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定，因此具有一定的局限性。此外，極體活檢從單個(gè)胚胎中所獲取的遺傳物質(zhì)數(shù)量極少，并且限制因素較多，例如PCR檢測(cè)過程中無(wú)法對(duì)等位基因進(jìn)行評(píng)估，因此該項(xiàng)技術(shù)并未得到廣泛應(yīng)用。

2.2 卵裂期(囊胚)活檢 胚胎細(xì)胞活檢是指在胚胎卵裂期，自6細(xì)胞胚胎至8細(xì)胞胚胎中取出1～2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活檢。與極體活檢相比，胚胎細(xì)胞活檢可以同時(shí)分析母源和父源的遺傳物質(zhì)，檢測(cè)范圍更廣。但由于遺傳物質(zhì)數(shù)量過少，相關(guān)檢測(cè)受到了限制，如在卵裂期發(fā)生嵌合的概率高達(dá)60%[6-7]，而胚胎細(xì)胞活檢對(duì)嵌合現(xiàn)象的檢測(cè)準(zhǔn)確性低等，因此容易產(chǎn)生誤診[8]。此外，在卵裂期取出個(gè)別細(xì)胞會(huì)延緩胚胎發(fā)育至囊胚期的時(shí)間，并可能由此導(dǎo)致著床率和受孕率下降[9-11]。

2.3 滋養(yǎng)外胚層活檢 世界上首例應(yīng)用滋養(yǎng)外胚層活檢和囊胚期移植技術(shù)進(jìn)行植入前基因檢測(cè)的嬰兒于2005年出生[12]。而隨著培養(yǎng)體系的不斷完善，囊胚期胚胎移植的受孕率顯著提高[13-14]。此外，經(jīng)SNP技術(shù)進(jìn)行序列分析，證實(shí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)外胚層遺傳特性高度一致[15]。因此，滋養(yǎng)外胚層活檢隨后被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中，并開始進(jìn)行多細(xì)胞活檢，大大減少了誤差，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。盡管與卵裂期胚胎相比，囊胚期胚胎的嵌合率較低，但仍無(wú)法完全避免由嵌合引起的誤差[16]，且多數(shù)生殖中心無(wú)法在同一個(gè)體外受精周期內(nèi)完成胚胎活檢、基因分析及移植[17]，因此在細(xì)胞被送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行活檢分析期間，需要將囊胚進(jìn)行冷凍保存，并在檢測(cè)完成后挑選適宜的胚胎進(jìn)行移植，這在一定程度上增加了難度和成本。

3 植入前基因檢測(cè)新技術(shù)新方法的應(yīng)用

早期的FISH是最先開始應(yīng)用于囊胚活檢的方法，其利用對(duì)有限數(shù)量的染色體進(jìn)行評(píng)估檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)非整倍體現(xiàn)象[18-19]。而隨著單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)的快速發(fā)展及應(yīng)用，使得同時(shí)對(duì)人類24條染色體進(jìn)行量化檢測(cè)成為可能，即全染色體篩選技術(shù)。全染色體篩選技術(shù)包含SNP芯片技術(shù)、aCGH芯片技術(shù)、定量PCR技術(shù)和NGS技術(shù)。

3.1 SNP芯片技術(shù) SNP芯片技術(shù)能夠在給定物種范圍內(nèi)一次性大量檢測(cè)基因組DNA的單核苷酸多態(tài)性差異。一次芯片分析通常情況下能夠檢測(cè)到基因組中大約30萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，并通過與參考基因組對(duì)比，確定全部染色體范圍內(nèi)的非整倍體、約250種常見結(jié)構(gòu)畸變以及單親二倍體現(xiàn)象[19-20]。SNP芯片技術(shù)還可用于比較雜合位點(diǎn)上兩等位基因間的差異，從而實(shí)現(xiàn)高分辨率和高重復(fù)性分子細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)[20]。但SNP芯片仍存在一定的局限性，如僅能檢測(cè)5 Mb以下的染色體結(jié)構(gòu)異常，無(wú)法檢測(cè)平衡染色體重排，以及無(wú)法檢測(cè)血親夫婦的基因異常(SNP位點(diǎn)純合)等[21-23]，而且從經(jīng)濟(jì)角度考量，SNP芯片也較為昂貴。

3.2 aCGH芯片技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)的比較 基因組雜交方法是將從囊胚中提取的DNA與正常對(duì)照組個(gè)體的DNA進(jìn)行分離和熒光標(biāo)記，并經(jīng)過3～5 d的雜交后再進(jìn)行分析比較。該技術(shù)隨后被aCGH芯片技術(shù)所取代，1個(gè)aCGH芯片中包含3 000～4 000個(gè)人類DNA片段，分辨率高達(dá)10 Mb，可檢測(cè)整條染色體以及大于10 Mb片段的非整倍體現(xiàn)象[20]。但aCGH芯片同樣存在局限性，它會(huì)剪切所有的染色體以匹配非整倍體狀態(tài)，而非染色體特異性剪切會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。此外，由于可用于植入前基因篩查的DNA數(shù)量較少，會(huì)導(dǎo)致aCGH檢測(cè)的錯(cuò)誤率達(dá)到2%～5%，但針對(duì)滋養(yǎng)外胚層活檢，應(yīng)用aCGH技術(shù)仍能夠保證較高的敏感性(99.8%)和特異性(99.6%)[24-25]。

3.3 定量PCR技術(shù) 定量PCR技術(shù)是一種能夠快速鑒別24條染色體非整倍體的方法，在滋養(yǎng)外胚層活檢分析中得到了較為廣泛的應(yīng)用[17，20]。該方法首先經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增，隨后通過多重PCR技術(shù)，使每條染色體的每條臂至少擴(kuò)增得到兩個(gè)序列。定量PCR的優(yōu)勢(shì)在于分析時(shí)間可縮短至4 h，能夠在同一受精周期內(nèi)進(jìn)行活檢和胚胎移植。并且通過對(duì)各條染色體進(jìn)行特異性剪切，具有較高的診斷準(zhǔn)確度(98.6%)[17，24]；而經(jīng)由比較基因組雜交檢測(cè)后，再使用定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)整倍體胚胎的診斷錯(cuò)誤率可低至0.21%[26]?，F(xiàn)行定量PCR技術(shù)的局限性在于還未在囊胚和極體活檢樣本上得到運(yùn)用，且同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的樣本數(shù)量較少，并且無(wú)法檢測(cè)到片段性非整倍體[17，20]。

3.4 NGS技術(shù) 應(yīng)用于植入前基因篩查的NGS技術(shù)包含全基因組DNA擴(kuò)增建庫(kù)，PCR擴(kuò)增前準(zhǔn)備，以及輸入DNA的標(biāo)記和片段化等[27]。應(yīng)用NGS檢測(cè)染色體非整倍體的靈敏度可達(dá)100%，特異性可達(dá)99.98%[28]。同時(shí)經(jīng)過aCGH和NGS檢測(cè)后，移植的整倍體囊胚臨床妊娠率和著床率分別達(dá)到63.8%和62.0%[27]。與aCGH技術(shù)相比，NGS成本較低，能夠同時(shí)對(duì)多樣本進(jìn)行檢測(cè)，自動(dòng)化程度極高，并且能夠?qū)Σ糠址钦扼w和嵌合現(xiàn)象進(jìn)行檢測(cè)。盡管NGS技術(shù)較為強(qiáng)大，但仍存在局限性，例如無(wú)法檢測(cè)到平衡染色體易位，以及由全基因組DNA擴(kuò)增引起的片段性非整倍體現(xiàn)象。

3.5 核型定位技術(shù) 核型定位技術(shù)應(yīng)用全基因組連鎖分析對(duì)夫婦雙方及已知遺傳性狀家庭成員間的SNP進(jìn)行比對(duì)，以確定等位基因SNP位點(diǎn)與攜突變?nèi)旧w間的關(guān)聯(lián)性[29]。核型定位技術(shù)無(wú)須等待家族特定候選基因探針的開發(fā)(3～4個(gè)月)，直接經(jīng)全基因組擴(kuò)增和基因分型，構(gòu)建核型庫(kù)，隨即將胚胎基因型與參考基因組進(jìn)行比較，由此確定是否受到親本攜突變遺傳的影響[30]。與PCR擴(kuò)增相比，該技術(shù)成本較高，但由于時(shí)間短、自動(dòng)化程度高，因而其運(yùn)行成本與PCR差距不大[23]。

4 地區(qū)差異性與需求帶來(lái)的思考

我國(guó)幅員遼闊，人口基數(shù)巨大，遺傳性疾病的發(fā)病絕對(duì)人數(shù)極高，因此通過植入前基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)植入前胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，對(duì)預(yù)防遺傳病，提高人口素質(zhì)和國(guó)計(jì)民生具有重大意義。由于社會(huì)的快速發(fā)展和自然環(huán)境的不斷變化，近年來(lái)，各類遺傳病發(fā)病率呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)，應(yīng)用植入前基因檢測(cè)技術(shù)，能夠?yàn)橛屑易暹z傳病史的夫婦提供臨床篩查服務(wù)，減少及阻斷單基因遺傳病的發(fā)生和世代遺傳，實(shí)現(xiàn)在基因?qū)用嫔项A(yù)防遺傳性疾病，對(duì)提高我國(guó)公共衛(wèi)生水平具有重要意義。

自1990年第1例植入前基因檢測(cè)嬰兒成功誕生以來(lái)，該技術(shù)在公眾和學(xué)術(shù)領(lǐng)域一直存在爭(zhēng)議。來(lái)自醫(yī)學(xué)、社會(huì)科學(xué)及人文科學(xué)界的人士認(rèn)為植入前基因檢測(cè)是人類優(yōu)生的一種新形式，通過對(duì)植入前胚胎進(jìn)行檢測(cè)和選擇，提供了一種超越產(chǎn)前診斷后終止妊娠的選擇機(jī)會(huì)。但另一部分學(xué)者認(rèn)為，與20世紀(jì)的優(yōu)生學(xué)不同，植入前基因檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用與人類發(fā)展進(jìn)程無(wú)關(guān)，更多的只是對(duì)個(gè)體及家庭因遺傳病所致痛苦的預(yù)防。在歐洲部分國(guó)家，監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)植入前基因檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行了極為嚴(yán)格的管理，對(duì)受試夫婦的年齡、遺傳病史、意向等進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選[31-32]，意在應(yīng)用植入前基因檢測(cè)技術(shù)幫助真正受遺傳病困擾的家庭，而非想借助該技術(shù)達(dá)成其個(gè)人目的和意愿的家庭，尤其是意在進(jìn)行性別選擇的家庭。但這些人文倫理層面的篩選和甄別難度較大，且主觀性較高，在實(shí)際從業(yè)過程中具有較高的不可控性。

另一方面，地區(qū)發(fā)展水平的差異及由此帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)條件差異，也為植入前基因檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用及初衷帶來(lái)了思考。與其他診療方法一樣，植入前基因檢測(cè)為受到遺傳疾病困擾的人群提供解決方案，能夠讓后代免受遺傳病困擾，但同時(shí)其高昂的檢測(cè)費(fèi)用也成為其推廣應(yīng)用的障礙之一。在美國(guó)，大多數(shù)醫(yī)療保險(xiǎn)公司都不會(huì)承擔(dān)植入前基因檢測(cè)的費(fèi)用。美國(guó)研究者在對(duì)遺傳病風(fēng)險(xiǎn)較高的18對(duì)夫婦進(jìn)行訪談時(shí)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)夫婦表示植入前基因檢測(cè)的成本問題是最大的障礙[33]。有研究者在澳大利亞對(duì)50位接受植入前基因檢測(cè)的女性進(jìn)行采訪時(shí)也發(fā)現(xiàn)，過高的檢測(cè)費(fèi)用令接受檢測(cè)者擔(dān)憂，而其家庭收入均已高于當(dāng)?shù)仄骄絒34]，但在地中海貧血高發(fā)國(guó)家(如沙特阿拉伯和伊朗等)，已對(duì)婚前育齡人群實(shí)行強(qiáng)制性的遺傳學(xué)篩查，以控制該遺傳病的發(fā)病。

針對(duì)上述兩方面的問題，在依靠社會(huì)和公眾力量，普及生殖知識(shí)，推廣優(yōu)生優(yōu)育理念的同時(shí)，也要推動(dòng)立法，將重大遺傳缺陷的篩查和植入前基因檢測(cè)列入國(guó)家醫(yī)療保險(xiǎn)，為經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)和遺傳病高發(fā)地區(qū)人民提供更多的優(yōu)生優(yōu)育選擇，為提高我國(guó)公共醫(yī)療衛(wèi)生水平提供保障。

5 結(jié) 語(yǔ)

植入前基因檢測(cè)很大程度上擴(kuò)展了體外受精和不孕不育的治療范圍，在解決生育問題的同時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)生育質(zhì)量的提高，可以使胚胎不受雙親攜帶的遺傳病以及非整倍體所帶來(lái)的困擾。相較于非整倍體和嵌合體胚胎，整倍體胚胎著床率和妊娠率均較高，因此，該技術(shù)的應(yīng)用也在一定程度上提高了生育率，保證了生育質(zhì)量。結(jié)合植入前基因檢測(cè)和產(chǎn)前篩查診斷，能夠有效減少由遺傳病和非整倍體所導(dǎo)致的新生患兒缺陷和死亡的現(xiàn)象。

隨著技術(shù)水平的不斷提升，用于植入前基因檢測(cè)的遺傳學(xué)診斷方法也不斷擴(kuò)展，針對(duì)不同的檢測(cè)需求，人們有了更多的選擇。相關(guān)技術(shù)的革新發(fā)展和生殖醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，使得植入前基因篩查和植入前基因診斷的應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)大和深入，將為患者提供更高的診斷精確度。而伴隨國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和區(qū)域協(xié)同發(fā)展的不斷擴(kuò)展，地區(qū)經(jīng)濟(jì)差異將進(jìn)一步縮小，將來(lái)能夠?yàn)楦嗍苓z傳病困擾的家庭提供經(jīng)濟(jì)上的便利。