徐婧， 周有連， 徐豪明， 聶玉強

廣州市第一人民醫(yī)院、華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科(廣東廣州 510180)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有逐漸上升趨勢。研究顯示，CRC居我國癌癥發(fā)病率和病死率的前5位[1]。一直以來，CRC篩查工作以糞便潛血結(jié)合結(jié)直腸鏡為主，但面臨內(nèi)鏡診斷流程多、患者依從性差、社區(qū)宣教普及困難等缺點。因此，尋找一種能夠?qū)RC進行早期診斷和預(yù)后評估的腫瘤標(biāo)記物刻不容緩[2-3]。循環(huán)游離DNA (circulating cell-free DNA，cfDNA) 是1948年發(fā)現(xiàn)的細胞外碎片DNA[4-5]，主要來自細胞壞死、凋亡。腫瘤細胞釋放的cfDNA通常稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA/cell-free tumor DNA，ctDNA)，其中一些能反映腫瘤的特異性特征，包括體細胞突變和異常的DNA甲基化模式，被認(rèn)為是極具臨床運用前景的腫瘤標(biāo)記物[6-9]。與組織活檢比，檢測ctDNA有許多方面的優(yōu)點：(1)檢測方法相對微創(chuàng)；(2)ctDNA能很好地代表患者腫瘤的特征，有很高的特異性；(3)通過動態(tài)監(jiān)測ctDNA定量和定性變化，可實時對患者的疾病復(fù)發(fā)和治療療效進行判斷；(4)檢測ctDNA能全面地了解腫瘤的遺傳學(xué)信息，避免組織活檢因腫瘤的異質(zhì)性而漏掉腫瘤部分生物學(xué)特征，從而更好地對患者的個體化治療提供選擇。本文結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于cfDNA的最新研究，對目前檢測cfDNA的方法和cfDNA在CRC中的應(yīng)用進展作一綜述。

1 cfDNA檢測方法

腫瘤細胞釋放的cfDNA占外周血總cfDNA很小一部分，所以需要高敏感性的方法對其進行檢測。常用的檢測方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和二代測序(NGS)包括全基因組測序和全外顯子組測序等?；趯崟rPCR的檢測方法廣泛地應(yīng)用于檢測低線(LoD)為0.1%～0.5%的cfDNA測量，但當(dāng)cfDNA用于檢測或監(jiān)測早期疾病時，ctDNA的比例往往低至0.01%。最近發(fā)展出許多基于PCR改進的檢測方法，包括基于等位基因定量PCR的Intplex技術(shù)，其敏感性范圍為0.004%～0.014%，以及乳液PCR技術(shù)如微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)、BEAMing數(shù)字PCR等，其敏感性范圍為0.001%～0.01%[7, 10-11]。PCR可對cfDNA中的遺傳學(xué)改變有較好的檢測，但存在每次只能分析少量位點的問題。而運用NGS可以在一次測序中同時對全基因組的遺傳學(xué)改變進行測量[12]，能顯著提高早期CRC患者cfDNA中體細胞突變的鑒定，但全基因組和全外顯子組測序的缺點是對于cfDNA的檢測分析敏感性很低。新近出現(xiàn)的靶向測序方法，將分子條碼和適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)篩選步驟與DNA片段的深度測序結(jié)合起來，從而對其敏感性有所改進[13-15]。除此之外，還有亞硫酸鹽測序法、特異性化學(xué)標(biāo)記法(hmC-Seal)等檢測cfDNA中的表觀遺傳學(xué)特點，為cfDNA的檢測賦予了更深層次的意義[16]。

2 cfDNA在CRC診療中的應(yīng)用

2.1 cfDNA與CRC的診斷 cfDNA檢測有微創(chuàng)性優(yōu)點，使得這一方法可能成為腫瘤早期篩查的新手段。大量研究表明，cfDNA水平的增高可能提示腫瘤的發(fā)生[17-19]，不過cfDNA不僅來源于腫瘤細胞，也來自正常細胞的壞死和凋亡，故在循環(huán)中含量很低，易受多種因素影響。特別是當(dāng)處于早期疾病時cfDNA的含量更低，所以利用cfDNA水平進行CRC篩查的敏感度和特異度都較低。Kopreski等[20]在8例CRC患者中成功檢測到其中5個KRAS突變的存在，但也在170個正常的沒有腫瘤表現(xiàn)的個體中檢測到37個有KRAS突變變化。與腫瘤相關(guān)的基因突變在少部分正常個體中也能被檢測到，有些研究發(fā)現(xiàn)來自健康個體的樣本中有0.45%～20%的cfDNA存在基因突變，尤其是TP53和KRAS突變[14, 21-23]，但結(jié)合甲基化水平能夠提升cfDNA的敏感度和特異度。

甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種改變形式，在2004年，Belinsky[24]指出超甲基化可能是癌癥發(fā)生和進展的關(guān)鍵因素。血漿cfDNA甲基化特征的檢測相比cfDNA的定量和腫瘤特異基因突變水平，對腫瘤的早期診斷有更高的特異性。Liu等[25]對68例終止治療的常見晚期癌癥患者血漿cfDNA中9 223個持續(xù)超甲基化CpG位點進行了全面的靶向甲基化測序，并以此進行甲基化評分，成功檢測出57例患者癌癥的存在且準(zhǔn)確分辨出45個的潛在腫瘤類型，其中，甲基化評分對于CRC探測和分類的準(zhǔn)確度最高，分別為96.3%、88.5%。

甲基化模式于腫瘤病理的早期出現(xiàn)，而且在CRC腫瘤中表現(xiàn)突出，這些特點都使得它對CRC的篩查有著重要的意義[26]。血漿中的循環(huán)SEPT9 DNA是目前對于診斷CRC的一種研究較多的甲基化標(biāo)記物。Church等[27]進行了一個大型的前瞻性研究，評估循環(huán)甲基化SEPT9 DNA在篩查人群中檢測CRC的準(zhǔn)確性。他們納入了7 900例計劃做內(nèi)窺鏡的參與者，發(fā)現(xiàn)其中53例CRC患者，循環(huán)甲基化SEPT9 DNA在篩查人群中檢測CRC的敏感度和特異度分別為48.2%、91.5%，檢測晚期腺瘤的敏感度為11.2%。上述結(jié)果顯示，血漿中的循環(huán)SEPT9 DNA是CRC的潛在腫瘤標(biāo)記物。類似基于甲基化cfDNA的研究眾多：如IKZF1/BCAT1、NPY/WIF-1、ALX4、APC、SFRP2、SDC2等[26]。結(jié)合多個甲基化生物標(biāo)記物能提高cfDNA對CRC的早期診斷能力，但這仍需要更多的臨床研究證明和敏感度更高的檢測技術(shù)支持[28]。

此外， DNA的羥甲基化也是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。5-羥甲基胞嘧啶不僅是主動去甲基化過程中的中間媒介，而且作為一個穩(wěn)定的DNA標(biāo)記，在腫瘤的早期診斷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，通過CRC患者和健康對照者血漿中5hmC的差異信號，能很好地分辨出CRC患者，利于CRC的早期診斷[16]。總的來說，通過追蹤cfDNA中的表觀遺傳修飾特點，我們可以進一步追溯該異常cfDNA的來源組織，從而實現(xiàn)對于CRC及其轉(zhuǎn)移的早期診斷。

2.2 cfDNA與CRC的療效評價 腫瘤的異質(zhì)性一直是腫瘤治療研究難以攻克的大難關(guān)，使得很多抗癌治療無法達到預(yù)期效果。cfDNA的動態(tài)變化為腫瘤異質(zhì)性和腫瘤進展評估提供了更便捷的方法，并且在時間上比常用的影像學(xué)方法能更早地判斷治療效果。de Figueiredo Barros等[29]分別檢測了組織樣本(原發(fā)和轉(zhuǎn)移性)和血漿樣本中5個腫瘤相關(guān)基因突變，血漿樣本檢測到的突變種類明顯多于組織樣本。同時，血漿樣本中ctDNA突變頻率也隨著化療進行而變化。在治療期間，計算機斷層掃描(CT)對于疾病進展的預(yù)測明顯晚于ctDNA。在Janku等[30]的研究中，通過相關(guān)性分析，表明經(jīng)歷全身治療患者中cfDNA VAF的變化與對放療反應(yīng)呈正相關(guān)。

cfDNA中的異常甲基化模式也可用來評估CRC患者的治療療效。Bhangu等[31]的研究納入34例肝切除術(shù)前接受新輔助化療治療的CRC肝轉(zhuǎn)移患者，并收集患者基線及每次新輔助化療周期前外周血血漿，分析48個CRC相關(guān)基因的異常甲基化。他們發(fā)現(xiàn)甲基化標(biāo)志物水平與腫瘤基線體積和治療反應(yīng)相關(guān), 且具有較高的敏感度和特異度，通過對CRC相關(guān)性甲基化標(biāo)記物的連續(xù)測量，可能對于接受新輔助化療的CRC肝轉(zhuǎn)移患者的早期療效評估有一定價值。

2.3 cfDNA與CRC的預(yù)后 在cfDNA中，部分腫瘤特異性變異與腫瘤預(yù)后有很好的相關(guān)性，如KRAS、BRAF等，常被用來檢測癌癥患者的預(yù)后。Perets等[32]用二代測序技術(shù)(NGS)對17例轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管癌患者血漿ctDNA進行KRAS突變分析，發(fā)現(xiàn)5/17(29.4%)患者血漿KRAS突變，且KRAS突變與更短的生存期相關(guān)；Janku等[30]在一項針對55例晚期癌癥患者的研究中，用超深下代測序(ultradeep NGS) 對 61個癌癥相關(guān)基進行突變分析，發(fā)現(xiàn) cfDNA變異等位基因頻率(VAF)高的患者，比VAF更低者存活時間更久。通過治療前后cfDNA中腫瘤特異性遺傳學(xué)變化，我們可以監(jiān)測腫瘤的進展可能，預(yù)測患者的無腫瘤生存期和選擇針對性更強的靶向藥物，實現(xiàn)精準(zhǔn)的個體化治療。最近抗腫瘤二、三線治療的研究數(shù)據(jù)表明，檢測到cfDNA中KRAS突變的CRC患者對于抗表皮生長因子受體(EGFR)靶向藥物治療的療效很差[33-35]。Wong等[36]的實驗也支持這一觀點，他們研究顯示，在瑞戈非尼治療期間，能在血漿中檢測到KRAS突變的CRC患者相比檢測不到KRAS突變患者，前者PFS更短。

cfDNA中的耐藥突變也可作為監(jiān)測CRC發(fā)展的良好指標(biāo)之一。有一個研究觀察到KRAS突變克隆隨治療而波動，在進展時KRAS等位基因的改變相對增加，而在EGFR阻滯劑停藥后則下降[37]。Bettegowda等[38]對比24例正進行抗EGFR治療的轉(zhuǎn)移性CRC患者實體瘤樣本，發(fā)現(xiàn)其血漿ctDNA中的耐藥突變也能檢測抗EGFR耐藥性。他們不僅檢測到了KRAS 基因突變，還檢測到了在疾病進展時的KRAS擴增[39]，而這些基因變化都可以通過對cfDNA的檢測而探測到。利用這些cfDNA改變，我們可以動態(tài)地觀察腫瘤進化，據(jù)此調(diào)整抗癌方案，使得患者有更好的療效和更少的毒性不良反應(yīng)。

除cfDNA中的腫瘤特異性遺傳學(xué)變化，cfDNA的總量也被認(rèn)為是CRC預(yù)后判斷和發(fā)展監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。Bettegowda等[38]的研究首次發(fā)現(xiàn)KRAS突變片段的水平和CRC患者更短的總生存時間相關(guān)。Bedin等[19]納入了114例CRC患者，與65例健康受試者和22例腺瘤病灶患者進行預(yù)后評估研究，結(jié)果顯示cfDNA水平升高與預(yù)后不良密切相關(guān)；一項對2003—2014年發(fā)表的包括1 022例CRC患者9項研究的Meta分析表明，cfDNA的定量檢測可預(yù)測無復(fù)發(fā)生存時間(RFS)和總生存時間(OS)[40]。但由于不同檢測cfDNA技術(shù)的敏感度和特異度的不同，導(dǎo)致檢測出的cfDNA水平也有差異，從而造成對疾病預(yù)后的估計有所偏差。最近一個研究將18F-FDG PET/CT所測得的全身基線代謝活性腫瘤體積與cfDNA基線水平結(jié)合起來，對轉(zhuǎn)移性CRC患者的預(yù)后也有很好的預(yù)測作用[41]。

3 展望

通過對cfDNA的定量、特異性基因突變和甲基化形式的檢測，我們可以將其運用于對CRC早期疾病和治療性手術(shù)后微小殘留灶的檢測、復(fù)發(fā)評估、治療療效和化療耐藥的評價，而這些在目前的研究中已經(jīng)取得了很多進展。不過，將cfDNA的檢測轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍有一定障礙。目前對于cfDNA的檢測技術(shù)并沒有標(biāo)準(zhǔn)化，這使得各個研究所測的cfDNA結(jié)果存在較大差異。我們已經(jīng)知道cfDNA來源于細胞壞死、凋亡以及少部分細胞的主動釋放，但對于cfDNA的來源和生理特征我們理解得并不深入，這些知識和檢測技術(shù)的發(fā)展也是相輔相成的。此外，將cfDNA的檢測用于臨床還需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的分析前程序，包括血漿的收集、獲取和儲存、cfDNA的抽取等。cfDNA由于自身性質(zhì)和腫瘤異質(zhì)性，利用其水平對腫瘤的檢測敏感度和特異度并不高，需要發(fā)展更靈敏和特異的檢測技術(shù)和更具特異性的cfDNA特征作為標(biāo)記物。此外，cfDNA在體內(nèi)含量低，也存在于健康個體中，不同時期的結(jié)直腸癌患者cfDNA檢測時間是變化的[42]，這些都為cfDNA的臨床價值帶來影響。

總的來說，未來仍需要大樣本量、前瞻性、多中心隨機對照實驗來驗證cfDNA在CRC診療中的作用，并結(jié)合多種cfDNA標(biāo)記物，提高檢測的敏感性和特異性。除此之外，我們還應(yīng)該加強對cfDNA的基礎(chǔ)和技術(shù)研究，以及早日達到檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。隨著對cfDNA檢測轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的更多努力，相信CRC的檢測和治療監(jiān)測思路會日益豐富，進一步實現(xiàn)個體化醫(yī)療和患者利益的提高，為更多的腫瘤患者帶來福音。