張文倩，王玉霞，左萌，徐丹

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的胎兒丟失[1]。引起RSA的原因眾多，主要包括染色體異常、免疫功能異常、遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、血栓前狀態(tài)、孕婦的全身性疾病及環(huán)境因素等[2]。除此之外，在臨床上仍有高達半數(shù)的病例病因不明，其妊娠丟失的病因及相關(guān)的分子學機制仍無法解釋，被稱為原因不明復發(fā)性流產(chǎn)（URSA）[3]。因此，為了系統(tǒng)和全面地研究RSA的病因，尋求更有效的治療方案，蛋白質(zhì)組學的研究方法越來越多地應(yīng)用于該疾病的病因?qū)W研究中。

蛋白質(zhì)組學是為了補充基因組學而出現(xiàn)的一個新的研究領(lǐng)域，主要研究細胞、組織、器官等中蛋白質(zhì)的表達、翻譯后修飾和相互作用。大多數(shù)學者一致認為，蛋白質(zhì)組學的研究使人類能深入了解某一特定時刻組織、細胞或生物體中蛋白質(zhì)功能表達[4]。雖然基因組學可以在基因活性和疾病相關(guān)性方面為人類提供有力證據(jù)，但很多疾病并非僅僅是由于基因改變引起的。人類基因組中大約只有3萬個基因，卻可以編碼超過50萬個蛋白質(zhì)，99.9%的人在基因水平上是相同的[5]。但基因在不同條件及時機的表達有差異，同樣的基因在不同情況下編碼的蛋白質(zhì)功能更是千差萬別。與基于DNA/RNA的技術(shù)相比，蛋白質(zhì)組學的主要優(yōu)勢就是直接研究蛋白質(zhì)的功能。因此，從蛋白質(zhì)組學分析中獲得的數(shù)據(jù)比依賴于DNA或mRNA研究的基因組學的結(jié)果更具有臨床相關(guān)性，也更容易轉(zhuǎn)化為診斷工具和治療手段。

在蛋白質(zhì)組學的研究中，主要有三大基礎(chǔ)技術(shù)支持，包括二維凝膠電泳（2-DE）技術(shù)、質(zhì)譜（MS）技術(shù)和生物信息學技術(shù)。近年來，隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展，同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)與MS技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用已成為蛋白質(zhì)定性和定量研究的主要工具之一[6]。最初，蛋白質(zhì)組學的技術(shù)主要應(yīng)用于藥物研究和腫瘤學領(lǐng)域，后來又逐漸應(yīng)用于心血管、神經(jīng)系統(tǒng)和腎病等各種臨床疾病的診斷。在婦產(chǎn)科疾病的應(yīng)用中，主要包括滋養(yǎng)細胞疾病、卵巢腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、妊娠期高血壓疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、流產(chǎn)和多囊卵巢綜合征等。因此，對于RSA這樣尚未完全明確病因的疾病，蛋白質(zhì)組學分析可以為其發(fā)病機制和臨床早期診斷提供一些新的思路，從分子水平上探索其發(fā)病機制，尋找可用于早期診斷的生物標志物，更精確地預測妊娠結(jié)局。

1 常用于進行蛋白質(zhì)組學分析RSA患者的體液與組織

隨著樣本制備方法的提高和MS技術(shù)的發(fā)展，越來越多的體液和組織都可以被用于進行蛋白質(zhì)組學分析。目前能用于檢測的生物體液和胎兒組織有很多，常見的包括血液、玻璃體液、腦脊液、滑膜液、乳汁、精液、羊水、宮頸及陰道分泌物、尿液、唾液、胎盤絨毛、羊膜和臍帶血等[7-8]。以下主要闡述卵泡液、胎盤絨毛、子宮內(nèi)膜和血液的蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果與RSA發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，分析蛋白質(zhì)組學應(yīng)用于臨床RSA診斷治療的發(fā)展前景。

1.1 卵泡液 卵泡液是在優(yōu)勢卵泡的發(fā)育過程中產(chǎn)生的，作為一種對卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟起重要作用的培養(yǎng)基，其成分非常復雜，主要包括蛋白質(zhì)、類固醇、多糖和代謝產(chǎn)物[9]。多項研究表明，卵泡液含有哺乳動物生殖過程中涉及卵泡生長和卵母細胞受精的基本物質(zhì)[10]。已證實巨噬細胞炎癥蛋白-3a、卵泡抑素、激活素和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族成員對卵泡細胞的增殖和分化有應(yīng)答作用[11-13]。卵泡液的成分可以作為卵泡細胞分泌活性和代謝情況的指標，在哺乳動物生殖過程中，卵泡液含有多種重要的生物蛋白，可以用于評估卵母細胞生長、成熟情況以及卵泡的質(zhì)量[14]。卵泡液作為一種類似血漿的復雜體液的代表，含有各種不同濃度的蛋白質(zhì)，能使我們更深入了解包括免疫因素在內(nèi)與生育相關(guān)的蛋白質(zhì)的組成情況[15]。因此，使用卵泡液作為鑒定RSA中蛋白質(zhì)的樣本，有助于發(fā)現(xiàn)RSA相關(guān)的診斷和預后標記物。

2006年，Kim等[16]首次采用基質(zhì)輔助激光解吸及電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和納米液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（nano-LCMS/MS）對RSA患者的卵泡液進行蛋白質(zhì)組學研究，結(jié)果鑒定出5種異常表達的蛋白：補體成分C3c鏈E、γ纖維蛋白原、抗凝血酶、血管緊張素原（AGT）和血凝酶前體，認為凝血因子（γ纖維蛋白原和抗凝血酶）在維持正常妊娠中發(fā)揮重要作用。此外，子宮內(nèi)膜癌及卵巢功能低下患者卵泡液的蛋白也存在異常表達[17-18]。這些研究方法及結(jié)果為進一步尋找卵泡液中RSA的特異性蛋白標記提供了新的思路。

1.2 胎盤絨毛 胎盤是在母體和胎兒之間輸送營養(yǎng)物質(zhì)、交換氣體和代謝產(chǎn)物的器官。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)RSA與胎盤細胞的凋亡過程密切相關(guān)，是B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）家族成員通過調(diào)控線粒體信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)從而調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑引起的[19-20]。凋亡過程勢必會發(fā)生凋亡相關(guān)蛋白的改變，因此分析胎盤絨毛的蛋白質(zhì)組學改變，有助于我們發(fā)現(xiàn)與RSA相關(guān)的特異性蛋白標記。

2018年P(guān)an等[21]利用iTRAQ技術(shù)和獨創(chuàng)性途徑分析（IPA）軟件的生物信息學技術(shù)對4例正常妊娠和4例RSA患者胎盤絨毛組織的蛋白質(zhì)組進行比較分析，發(fā)現(xiàn)有314種蛋白在胚胎發(fā)育過程中起著重要作用，其中AGT、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）和凝血酶原片段2（F2）是早期胚胎發(fā)育的核心因素。通過對這些胎盤絨毛中特異性蛋白的研究和分析，可以使我們更加深入地探索RSA的病因和發(fā)病機制。

1.3 血液 在臨床實踐中，與卵泡液和胎盤絨毛相比，血液更容易獲得，患者也比較容易接受。因此血液更廣泛地應(yīng)用于RSA的診斷。最常用的血液樣本是血漿和血清。血漿是指抽取的血液置入含抗凝劑的試管離心后獲取的無細胞的上清液；而血清則是凝血完成后，纖維蛋白凝結(jié)并去除后得到的細胞外部分的上清液。在凝血的過程中，血清中的纖維蛋白被去除，因此與血漿中的蛋白含量有一定的差別。以往的研究表明，血漿應(yīng)該是臨床試驗和蛋白質(zhì)組學研究的首選來源[22]。

Kim等[23]研究收集了3例有RSA病史患者的血樣和3例無流產(chǎn)史健康婦女的混合血樣，采用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了22種差異表達的蛋白，其中5種蛋白經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）被證實，而間α胰蛋白酶抑制劑-重鏈4（ITI-H4）最具特殊意義，或可作為RSA的生物標志物。因此，血液蛋白質(zhì)組學的研究對于探索RSA的發(fā)病機制和血液標志物也具有重要意義。

1.4 子宮內(nèi)膜 隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展，研究人員試圖在更多的組織中尋找生物標志物。近年來，一些研究者采用蛋白質(zhì)組學分析來探討子宮內(nèi)膜與RSA之間的關(guān)系。Weimar等[24]研究認為，人類子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（ESCs）的遷移和侵襲能力與胚胎植入、滋養(yǎng)細胞和子宮內(nèi)膜再生相關(guān)。因此，子宮內(nèi)膜的異常變化與RSA的發(fā)病機制有一定的關(guān)系，對子宮內(nèi)膜的研究仍然是RSA研究的重要組成部分。

體質(zhì)量指數(shù)（BMI）的增加可增加流產(chǎn)風險。Metwally等[25]研究收集了16例RSA患者（12例為BMI≥25 kg/m2的肥胖患者、4例為BMI在19.5～24.9 kg/m2之間的患者）和5位正常育齡婦女（2例肥胖患者、3例為BMI正常者）的子宮內(nèi)膜，利用2-DE分析得出肥胖RSA患者結(jié)合珠蛋白（Hpt）的表達水平明顯高于BMI正常的RSA患者。上述研究為肥胖RSA婦女子宮內(nèi)膜蛋白改變提供了初步證據(jù)，這種改變主要表現(xiàn)為與肥胖相關(guān)的炎癥標志物——結(jié)合血紅蛋白的增加。雖然對子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組學研究仍處于起步階段，但也為尋找引起RSA的內(nèi)膜因素給出了新的思路。

2 臨床標本的選擇

臨床標本的選擇應(yīng)遵循易獲得、損傷小、穩(wěn)定性高的原則。雖然許多體液和組織都可以用于蛋白質(zhì)組學分析，但樣本的獲取并不容易。在收集樣本的過程中，除了要根據(jù)自身的研究需要選擇不同特性的樣本，還要嚴格控制采樣的每一步驟，按照標準的操作流程對不同的標本進行處理。這樣才能使科研結(jié)果更加準確和具有權(quán)威性，也有利于科研成果的借鑒和分享。

卵泡液的特點是其作為卵母細胞生長的微環(huán)境，對卵泡發(fā)育和卵母細胞的成熟都發(fā)揮著重要的作用。并且卵泡液的成分與血漿成分非常類似，可以直接反映顆粒細胞和膜細胞的新陳代謝活動以及卵泡滲透率的變化。但是，卵泡液通常需要在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）時獲取，所以相對于血液和尿液而言，標本的獲取尤為困難，對操作的要求更加嚴格。客觀來講，并不適合成為廣泛應(yīng)用于臨床疾病篩選的樣本。

胎盤絨毛滋養(yǎng)層組織對維持正常妊娠起著重要作用，其生物學特性又與其表面蛋白質(zhì)的變化有關(guān)。由此可知，通過對胎盤絨毛蛋白質(zhì)組學的研究，對闡明著床過程和維持正常妊娠過程中一些未知而關(guān)鍵的問題有重要意義。但是，胎盤絨毛通常需要在患者行人工流產(chǎn)時獲取，所以很難判斷蛋白質(zhì)的改變是發(fā)生在流產(chǎn)前還是流產(chǎn)后，勢必會對結(jié)果的分析判斷造成干擾，也不利于尋找預測流產(chǎn)發(fā)生的生物學標志物。

受精卵的著床及胚胎的發(fā)育均與子宮內(nèi)膜的容受性密切相關(guān)，而子宮內(nèi)膜的特異性蛋白表達又與其容受性有關(guān)。且子宮內(nèi)膜容易獲得，只要對取材的位置和時間做出統(tǒng)一的要求，掌握內(nèi)膜周期性變化的規(guī)律，就可以將子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組學分析用于臨床，篩選出流產(chǎn)相關(guān)蛋白，并將其作為預測流產(chǎn)的重要標志物。

血漿在生物標志物的研究中被廣泛應(yīng)用，因為幾乎所有其他體液都直接或間接受到血漿的影響，血漿在體內(nèi)直接接觸鄰近組織并與鄰近組織的功能密切相關(guān)，從組織中分泌和轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)在血漿中很容易獲得。血漿的優(yōu)點是其所含蛋白質(zhì)的種類多且性質(zhì)各異，作用重要，可以幫助我們認識疾病的演變過程。但血漿中97%的蛋白質(zhì)是由以下7種主要的高豐度的血漿蛋白組成，分別是白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和脂蛋白。由于血漿中高豐度蛋白的含量高，因此對其進行蛋白質(zhì)分離和鑒定的難度更大，定量檢測要求更高，對實驗結(jié)果的影響也更大。眾所周知，低豐度蛋白才是與疾病密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，因此去除高豐度蛋白尤為重要。迄今為止，所有去除高豐度蛋白的方法都不可避免地導致與其結(jié)合的中、低豐度蛋白的丟失[26]。血漿作為樣本進行蛋白質(zhì)組學分析的另一個缺陷是血漿的性質(zhì)不穩(wěn)定，易受取材和儲存方式的影響。由于個體的遺傳背景、年齡、生活方式和藥物使用等各不相同，循環(huán)血漿中蛋白質(zhì)的濃度也會發(fā)生改變。盡管如此，由于所有的體液和組織都與血漿有關(guān)，說明血漿中的蛋白質(zhì)變化可以反映出整個機體的功能變化。另外血漿的采集過程更為便捷，更加容易被患者接受，因此只要對血液樣本的采集過程進行嚴格控制，從血漿中提取和篩選出的流產(chǎn)相關(guān)蛋白就有望成為臨床早期預測流產(chǎn)的指標。

3 結(jié)語

綜上所述，各種體液和組織都是潛在疾病生物標志物的重要來源，當一種疾病發(fā)生時，體液和組織中蛋白質(zhì)表達譜的變化有助于了解疾病的機制。而血漿和子宮內(nèi)膜作為各種體液和組織中最易獲取的樣本，具有早期發(fā)現(xiàn)RSA、監(jiān)測疾病進展的潛在應(yīng)用價值。因此，子宮內(nèi)膜和血漿的蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)的特異性蛋白最有望成為臨床早期診斷RSA的生物學標志物。然而，為了將蛋白質(zhì)組學技術(shù)更好地應(yīng)用于RSA發(fā)病機制的研究，尋找更加便捷可靠的診斷指標，還面臨著諸多挑戰(zhàn)與困惑。首先，盡管許多體液和組織都可以用于進行蛋白質(zhì)組學分析，但實際獲取相對困難；其次，雖然部分蛋白質(zhì)的表達有差異，但是獲取真正具有臨床診斷價值的標志物仍然很艱難，需要長期大量的實驗和探索；再次，由于取樣方法和實驗方法缺乏統(tǒng)一性，不同研究機構(gòu)的數(shù)據(jù)之間無法進行有效的對比分析，數(shù)據(jù)重復性差，不能得到研究者的廣泛認可；最后，由于該項技術(shù)應(yīng)用成本非常高，讓許多經(jīng)費拮據(jù)的研究者望而卻步。因此，我們要科學、客觀地面對各樣本的優(yōu)勢和劣勢，依靠臨床學科、基礎(chǔ)學科、生物信息學和統(tǒng)計學等各學科研究者們共同的努力，開拓蛋白質(zhì)組學技術(shù)在婦產(chǎn)科疾病中更廣闊的應(yīng)用前景。