陳歡，吳畏

無論是自然受孕還是體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET） 受孕，非整倍性染色體異常都是妊娠失敗的主要原因。輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）的有效性取決于移植胚胎的質(zhì)量及種植潛能。植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）可篩選染色體正常的胚胎進(jìn)行移植，增加種植率、降低流產(chǎn)率從而增加了IVF的有效性，在ART和臨床優(yōu)生學(xué)中占有重要的地位。近來對(duì)PGT后代的隨訪發(fā)現(xiàn)，PGT可能對(duì)胚胎發(fā)育造成影響，促使更多關(guān)于非侵入性植入前遺傳篩查（noninvasive preimplantation genetic screening，NIPGS）的研究。本文綜述PGT尤其NIPGS在ART中的應(yīng)用及發(fā)展前景。

1 PGT技術(shù)的起源與發(fā)展現(xiàn)狀及適用范圍

1.1 PGT技術(shù)的起源與發(fā)展現(xiàn)狀 傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法主要是通過絨毛活檢、羊膜腔穿刺等方法取得胎兒相關(guān)樣本，然后進(jìn)行染色體核型分析。然而這些技術(shù)均為有創(chuàng)性，有流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。隨著ART及測序技術(shù)的發(fā)展，PGT開始應(yīng)用于臨床。第一例成功的PGT由Handyside等[1]于1990年完成，該病例利用鑒定Y染色體的存在來減少生育母源性X連鎖隱性疾病患兒的機(jī)會(huì)。此后遺傳學(xué)家開始嘗試使用單細(xì)胞聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、熒光原位雜交（FISH）、微陣列比較基因組雜交（aCGH），單核苷酸多態(tài)性微陣列（SNP array）以及高通量測序技術(shù)（NGS）對(duì)來自極體、卵裂期胚胎的卵裂球、滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測[2-4]。各活檢時(shí)間優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1，目前用于PGT各種檢測技術(shù)比較見表2。

1.2 PGT技術(shù)適用范圍 目前PGT主要分為單基因異常檢測（PGTfor monogenic，PGT-M）、染色體結(jié)構(gòu)異常（PGTfor structural rearrangements，PGT-SR）和非整倍體篩查（PGTfor aneuploidies，PGT-A）三大類。PGT-M主要應(yīng)用于檢測單基因遺傳病，目前文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行PGT-M的單基因遺傳病多達(dá)數(shù)百種。PGT-SR主要應(yīng)用于檢測染色體病，包括染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。PGT-A可應(yīng)用與高齡、反復(fù)IVF種植失敗以及反復(fù)妊娠丟失患者，選擇染色體正常胚胎移植可以提高妊娠率，降低流產(chǎn)率。還可應(yīng)用于人類白細(xì)胞抗原（HLA）分型、線粒體相關(guān)疾病以及攜帶有癌癥等疾病易感基因的人群。對(duì)于妊娠中檢測到的這些疾病，不同國家處理方式不同，如人工流產(chǎn)、宮內(nèi)治療或繼續(xù)妊娠。PGT是產(chǎn)前診斷的最早形式，進(jìn)行PGT可有效地避免因胎兒染色體異常等的選擇性流產(chǎn)。

然而，即使染色體正常也不能確保成功妊娠。導(dǎo)致著床失敗的其他因素包括線粒體拷貝變異與核DNA比例改變導(dǎo)致的胚胎應(yīng)激狀態(tài)[使用過的第3天的培養(yǎng)基中線粒體DNA（mtDNA）可作為胚泡潛能和植入結(jié)果的評(píng)估標(biāo)志[8]]、新發(fā)缺失（dels）或重復(fù)（dups）、自身免疫因子紊亂、子宮內(nèi)膜容受性降低、內(nèi)分泌異常、解剖異?；蚱渌粗蛩氐萚9]。同時(shí)需向患者普及檢測方法的相關(guān)知識(shí)及對(duì)檢測結(jié)果給予指導(dǎo)，特別是對(duì)于嵌合胚胎根據(jù)染色體異常類型及嵌合比例給予相應(yīng)的遺傳咨詢。

表1 各活檢時(shí)間優(yōu)缺點(diǎn)

表2 PGT檢測技術(shù)比較

2 目前PGT技術(shù)存在的問題

2.1 檢測樣本的結(jié)果是否可以準(zhǔn)確反映整個(gè)胚胎的遺傳組成 利用aCGH行PGT診斷的準(zhǔn)確度為95%～98%，SNParray行PGT準(zhǔn)確度為96.5%～99.8%，NGS行PGT準(zhǔn)確度為99.5%～100%[10]。各種檢測方法檢測結(jié)果不一致的原因有以下幾個(gè)方面。①嵌合體胚胎：含有2種及以上不同染色體組成細(xì)胞系的胚胎被稱為嵌合體胚胎，局部取材的偏差可導(dǎo)致錯(cuò)誤的診斷。PGD國際協(xié)會(huì)（PGDIS）規(guī)定異常細(xì)胞占比20%～80%為嵌合體胚胎，目前PGDIS指南及多數(shù)研究認(rèn)為在無整倍體胚胎移植情況下，可嘗試移植嵌合體胚胎，且基于嵌合水平及特定染色體選擇優(yōu)先移植順序，并且妊娠后需進(jìn)行產(chǎn)前診斷[11]。②囊胚后期具有自我修復(fù)的能力：小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)非整倍體胚胎具有自我修復(fù)能力[12]，目前其機(jī)制的假說有正常細(xì)胞優(yōu)勢生長、異常細(xì)胞自我糾正和正常細(xì)胞向內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集[13]。③等位基因脫扣（allele dropout，ADO）：其發(fā)生機(jī)制可能包括DNA退化，導(dǎo)致DNA雙鏈裂解不完全；PCR反應(yīng)條件不完善，細(xì)胞裂解不完全；UPD等。這些問題的發(fā)生率與檢測樣本量大小相關(guān)，囊胚期樣本量較卵裂期大，故囊胚期活檢可顯著降低ADO率，同時(shí)多重?zé)晒釶CR可有效解決ADO問題。④DNA污染：來源包括精子、顆粒細(xì)胞以及操作者的DNA等，可通過嚴(yán)格控制操作流程及采用胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精方式減少污染。

2.2 活檢本身對(duì)胚胎發(fā)育可能的影響 Kirkegaard

等[14]采用延時(shí)成像（time-lapse）觀察對(duì)比活檢和未活檢的D3胚胎，發(fā)現(xiàn)活檢后的囊胚細(xì)胞分裂融合至囊胚期的時(shí)間明顯延長。近年研究數(shù)據(jù)表明，胚胎活檢后可能降低胚胎發(fā)育潛力[15]，動(dòng)物研究顯示胚胎活檢對(duì)神經(jīng)和腎上腺發(fā)育有負(fù)面影響[16-18]；而對(duì)人PGT子代隨訪發(fā)現(xiàn)18月齡兒精細(xì)動(dòng)作、姿勢和肌張力等與對(duì)照組（未行PGT的ART子代）有輕微差別，2歲的幼兒較對(duì)照組有輕度神經(jīng)系統(tǒng)異常[19-20]。

2.3 胚胎冷凍復(fù)蘇的影響 診斷胚胎需凍存，約5%～10%的胚胎不能耐受冷凍及復(fù)蘇過程[21]。

2.4 胚胎生物學(xué)方面相關(guān)因素 如線粒體拷貝數(shù)，研究表明其與卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛力有關(guān)，具有高水平mtDNA的胚胎非整倍性風(fēng)險(xiǎn)升高，可能與植入失敗有關(guān)。

3 NIPGS的起源及發(fā)展

3.1 NIPGS的起源 最理想的PGT形式是獲得代表整個(gè)待測胚胎遺傳構(gòu)成的活檢材料，而不影響發(fā)育潛力。由于現(xiàn)有活檢技術(shù)對(duì)胚胎發(fā)育的影響，人們一直在尋找無創(chuàng)及有效的胚胎檢測方法。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了胎兒非整倍性和單基因遺傳病的非侵入性產(chǎn)前檢測[22-23]。細(xì)胞凋亡似乎是胎兒DNA從胎盤釋放到母體循環(huán)中的主要途徑，而研究發(fā)現(xiàn)胚胎體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞凋亡和游離DNA的釋放也有發(fā)生。NIPGS的理論基礎(chǔ)為研究證明在囊胚腔液（blastocoelefluid，BF）或胚胎培養(yǎng)液（spent culture medium，SCM）發(fā)現(xiàn)的DNA很可能來源于生長胚胎中的凋亡細(xì)胞。使用DNA特異性熒光染料對(duì)滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)核進(jìn)行差異標(biāo)記，研究發(fā)現(xiàn)在囊胚擴(kuò)張時(shí)檢測到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞凋亡波。通過測序，BF中DNA片段的優(yōu)勢群體長度與源自凋亡胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的游離DNA長度相似[23-26]。然而有部分學(xué)者提出這種DNA來源于胚胎丟棄的細(xì)胞作為非整倍性的校正機(jī)制[27]，但是由于非整倍體胚胎與整倍體胚胎的培養(yǎng)基中游離DNA的數(shù)量并沒有顯著增加，因而排除了這一假設(shè)[28]。因此，胚胎釋放的游離DNA可進(jìn)行富集及遺傳分析來診斷胚胎染色體非整倍體疾病，是目前唯一一種沒有侵入性的胚胎遺傳學(xué)診斷和分析技術(shù)。

3.2 NIPGS的臨床研究 2013年，Stigliani等[29]在SCM中檢測到胚胎mtDNA，發(fā)現(xiàn)其與胚胎碎片率相關(guān)。同年P(guān)alini等[30]在BF中發(fā)現(xiàn)可用于基因分析的DNA。2014年Gianaroli等[31]使用BF進(jìn)行了PGT的初步研究。2015年Herrera等[32]在SCM中也發(fā)現(xiàn)了可用于基因分析的DNA，Wu等[33]報(bào)道了基于SCM的α地中海貧血胚胎相關(guān)基因檢測，并與卵裂球擴(kuò)增檢測結(jié)果比較，證實(shí)了無創(chuàng)PGT的應(yīng)用潛力。但NIPGS各研究游離DNA和胚胎遺傳檢測結(jié)果的一致性差異較大，見表3。

目前研究中SCM+BF組合樣品的擴(kuò)增效率和效用較好，將胚泡液釋放到培養(yǎng)基中以增加DNA的濃度。有研究認(rèn)為在玻璃化之前通過微針或激光脈沖人工收縮囊胚可以提高胚胎的存活率和臨床效果[38，40]。

表3 各臨床研究檢測結(jié)果一致性比較 [%（n/n）]

3.3 NIPGS應(yīng)用的優(yōu)勢及局限性 NIPGS的優(yōu)勢在于刪除昂貴的顯微操作活檢程序并且避免了細(xì)胞移除相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。并且除了BF其余都是胚胎冷凍保存的常規(guī)操作，防止晶體形成并提高冷凍保存后的胚胎存活率[41]。但其仍存在較多局限性：①胚胎DNA釋放的機(jī)制仍未完全了解；②細(xì)胞凋亡是胚胎自我修復(fù)過程，理論上非整倍體細(xì)胞首先被淘汰，檢測有假陽性可能；③培養(yǎng)液DNA污染：a.卵丘細(xì)胞引起的母體污染，在進(jìn)行ICSI之前，要求去除所有卵丘細(xì)胞（母體來源并且通常具有正常的染色體組成），如果這種去除不完全，殘留的細(xì)胞可能在胚胎發(fā)育過程中釋放DNA，從而可能成為假陰性檢測結(jié)果的原因，可通過仔細(xì)徹底地去除所有胚胎培養(yǎng)前的卵丘細(xì)胞，進(jìn)一步減少假陰性率；b.精子附著在透明帶上引起父源污染的風(fēng)險(xiǎn)，與PGT類似，建議與ICSI一起進(jìn)行，確保去除附著在透明帶上的任何額外精子；④胚胎嵌合現(xiàn)象可引起的檢測結(jié)果假陽性：可以在第6天進(jìn)行胚泡活檢來驗(yàn)證假陽性[24]；⑤利用SCM進(jìn)行無創(chuàng)PGT-A需要胚胎單獨(dú)培養(yǎng)取代常規(guī)的共培養(yǎng)，失去了共培養(yǎng)的優(yōu)勢，增加了費(fèi)用。

4 結(jié)語與展望

目前測序成本已大幅下降，PGT技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，但存在嵌合體的胚胎檢測困難，并且PGT可能對(duì)胚胎發(fā)育及子代有影響。而NIPGS沒有活檢細(xì)胞，移除了對(duì)胚胎發(fā)育及子代可能的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，是一項(xiàng)安全、極具潛力的技術(shù)，但其常規(guī)應(yīng)用于臨床實(shí)踐仍然需要更多的研究和技術(shù)改進(jìn)來完善。目前ART中評(píng)估和選擇最佳胚胎主要基于胚胎形態(tài)學(xué)分級(jí)，希望在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和延時(shí)成像領(lǐng)域的進(jìn)一步研究可以幫助選擇最佳胚胎。