李玲君，張月鑫，崔毓桂

山梨醇，又名D-葡萄糖醇，是一種六碳多元醇，天然存在于蘋果、梨、桃、杏和一些蔬菜中，具有很高的吸濕性，可防止水分流失，常用于糖果產(chǎn)品中[1]。細胞內(nèi)的山梨醇代謝旁路，又稱多元醇代謝旁路，是葡萄糖代謝的通路之一，即葡萄糖在醛糖還原酶（AR）催化下生成山梨醇，再經(jīng)過山梨醇脫氫酶（SORD）作用轉(zhuǎn)化為果糖[2]。生理條件下該通路是葡萄糖代謝的補償通路而處于低水平激活狀態(tài)；在高血糖等病理生理學過程中，細胞內(nèi)這條通路被異常激活參與葡萄糖代謝，導致山梨醇、果糖積累，糖基化終產(chǎn)物（AGE）形成，細胞內(nèi)的氧化-還原失衡、活性氧簇（ROS）升高，與多種疾病密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇旁路被異常激活是糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制之一，通過某種方式抑制該旁路是有潛在前景的預防或控制糖尿病慢性并發(fā)癥的手段[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇代謝旁路在生殖系統(tǒng)中具有某些作用，盡管目前尚未明確，例如睪丸、附睪及其他附性腺均表達AR和SORD，提示山梨醇旁路可能的作用[4-5]；山梨醇旁路還與卵母細胞成熟有關(guān)，在卵母細胞體外成熟（IVM）培養(yǎng)液中添加高濃度山梨醇對卵母細胞成熟產(chǎn)生負面影響[6-8]。本文介紹細胞內(nèi)山梨醇代謝旁路及其在生殖領(lǐng)域的研究進展。

1 細胞內(nèi)山梨醇代謝旁路

組織細胞內(nèi)葡萄糖代謝的山梨醇代謝旁路，是由兩種酶催化的兩步反應(yīng)（見圖1），葡萄糖首先在AR的催化下生成山梨醇，同時將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）轉(zhuǎn)化成為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）；第二步山梨醇在SORD的催化下生成果糖，同時將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。

圖1細胞內(nèi)葡萄糖代謝的山梨醇旁路

1.1 AR AR為山梨醇代謝旁路的限速酶，屬于醛-酮還原酶超家族的一員，是一種以胞漿NADPH為輔酶的氧化還原酶[9-10]。人類AR由315個氨基酸殘基構(gòu)成，呈β/α三維桶狀結(jié)構(gòu)，催化活性中心位于桶芯，NADPH輔助因子連接在β/α桶的羧基（—COOH）末端的頂端[9-10]。由于AR與葡萄糖的親和力很低，在血糖正常時細胞內(nèi)葡萄糖大多經(jīng)由糖酵解途徑代謝；山梨醇代謝旁路作為葡萄糖代謝的一條補償通路而處于低水平狀態(tài)，生理條件下該旁路代謝的葡萄糖極少[11]。當血糖增高時，己糖激酶飽和，會刺激AR生成和酶活化，激活山梨醇代謝旁路，增加了葡萄糖通過該旁路的代謝[11]。

葡萄糖并不是AR唯一底物，其他底物還包括異己醛、4-羥基-反式-2-壬醛（4HNE）和4HNE谷胱甘肽加合物（GS-HNE）等[12-13]。異己醛是類固醇激素合成第一步膽固醇氧化分解側(cè)鏈斷裂生成的產(chǎn)物之一，人、狗、兔、猴腎上腺內(nèi)的異己醛主要通過AR代謝[12]。4HNE為脂質(zhì)過氧化主要的終產(chǎn)物之一，細胞內(nèi)高濃度4HNE可通過c-Jun氨基末端激酶（JNK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）等多種途徑誘導細胞凋亡信號傳導，GS-HNE是其代謝的一種中間形式[14]。細胞內(nèi)ROS升高導致脂質(zhì)過氧化增加，4HNE升高，4HNE的積累誘發(fā)細胞內(nèi)凋亡信號，AR與4HNE反應(yīng)后可降低4HNE和GS-HNE的細胞毒性[13-14]。

AR還原葡萄糖同時消耗NADPH。NADPH是還原型谷胱甘肽（GSH）的再生輔助因子，而GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑，NADPH降低會導致GSH消耗進而加劇細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[3]。

1.2 SORD SORD催化山梨醇轉(zhuǎn)化為果糖。SORD屬于中鏈脫氫酶/還原酶蛋白家族。人類SORD為四聚體，每個亞基由356個氨基酸殘基和一個鋅原子組成，形成兩個β桶狀結(jié)構(gòu)，兩者之間有縫隙，而催化活性中心位于縫隙的底部[15]。SORD的輔酶結(jié)合域是經(jīng)典的羅斯曼（Rossmann）折疊，可逆性結(jié)合輔助因子NAD+[15]。SORD催化山梨醇2號位碳上的氫對NAD+煙酰胺的4號位碳親核取代，將山梨醇轉(zhuǎn)變成果糖并生成NADH[16]。除D-山梨醇外，SORD底物還包括L-艾杜醇、D-木糖醇和D-半乳糖醇等[17]。

SORD將山梨醇轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑耐瑫r，使細胞內(nèi)NADH積累。線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ催化2個電子從NADH轉(zhuǎn)移到醌池，并將質(zhì)子從線粒體內(nèi)泵入膜間隙產(chǎn)生質(zhì)子梯度，為ATP生成做準備。當NADH過高時，線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ不斷將其氧化為NAD+，導致復合物Ⅰ過載，形成更多超氧化物[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟和肌肉線粒體內(nèi)高膜電位的條件下，ROS和NADH同步改變，NADH積累、NAD+/NADH比值下降促進ROS生成[19]。

總之，SORD催化山梨醇轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑耐瑫r，NADH積累，ROS生成增多，導致細胞內(nèi)氧化-還原失衡，氧化應(yīng)激增加。

2 山梨醇代謝旁路與相關(guān)疾病

山梨醇代謝旁路與多種疾病有關(guān)，研究最多的是其與糖尿病并發(fā)癥間的聯(lián)系[20-22]。

2.1 糖尿病及其并發(fā)癥 在高血糖狀態(tài)下，細胞內(nèi)30%的葡萄糖通過山梨醇代謝旁路被代謝，該旁路的激活使NADPH減少，NAD+/NADH比值降低，導致細胞內(nèi)氧化-還原失衡。同時，反應(yīng)生成的山梨醇和果糖積累，導致細胞內(nèi)滲透壓升高，細胞功能受損[3]。果糖及其代謝產(chǎn)物3-磷酸果糖和3-脫氧葡萄糖是比葡萄糖更有效的非酶糖化劑，AGE與其受體結(jié)合也引起氧化應(yīng)激[23]。以上均為糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制，如在糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病等微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中，ROS的增高、山梨醇積累、AGE形成，通過氧化應(yīng)激機制激活蛋白激酶C（PKC），誘導細胞因子、趨化因子以及不同的炎癥和凋亡信號，破壞微血管，引發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病[20-21]。

研究糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)施旺細胞內(nèi)山梨醇代謝旁路高激活，山梨醇和果糖濃度增加，細胞內(nèi)滲透壓升高，促進細胞內(nèi)電解質(zhì)流出，影響細胞功能。細胞內(nèi)山梨醇和果糖積累，還降低肌醇和牛磺酸濃度，因此抑制Na+-K+泵，使細胞內(nèi)Na+積累導致軸突和軸索腫脹，神經(jīng)膠質(zhì)功能障礙和神經(jīng)傳導速度（NCV）降低。此外，AR消耗NADPH和GSH；SORD使細胞內(nèi)NADH積累、NAD+/NADH比值減小，導致血管內(nèi)皮神經(jīng)損傷及NO介導的血管舒張功能喪失；該通路還使神經(jīng)、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性升調(diào)節(jié)，在糖尿病神經(jīng)病變中起著重要作用[22]。

有研究顯示，阿爾茨海默病腦區(qū)的山梨醇和果糖濃度顯著升高，提示山梨醇代謝旁路被激活，可能與阿爾茲海默病神經(jīng)病變有關(guān)[24]。今后需要更多研究探討山梨醇代謝旁路在其發(fā)生發(fā)展中的作用。

2.2 缺血/再灌注（I/R）損傷 研究顯示，山梨醇代謝旁路在I/R損傷中起負面效應(yīng)。脂肪肝小鼠模型的肝臟I/R處理，與對照組相比，腹腔注射AR抑制劑后能減少I/R引起的NADPH損失、改善氧化-還原失衡、顯著增強B淋巴細胞瘤2（bcl-2）和其與Bcl-2相關(guān)X蛋白比值（bcl-2/bax）、抑制caspase-3活化、提高GSH胞漿含量、降低丙二醛（MDA），因此明顯減低I/R損傷。人L02肝細胞系高表達AR后再采取缺氧/復氧（H/R）的處理，與未誘導AR高表達的對照組相比，細胞內(nèi)MDA增多，肝細胞膜受損程度增高，線粒體膜電位水平被破壞，細胞凋亡增加。提示山梨醇代謝旁路會增加肝細胞對I/R事件的敏感性，小分子AR抑制劑則通過抑制山梨醇代謝旁路可能成為脂肪肝缺血/再灌注損傷中保護肝臟的有效輔助方法[25]。

正常小鼠肝臟I/R處理同時應(yīng)用SORD抑制劑，能顯著減輕I/R引起的肝臟組織學改變和肝細胞損傷。抑制SORD活性，逆轉(zhuǎn)了I/R引起的NAD+/NADH失衡，降低I/R誘導的ROS和氧化應(yīng)激，抑制肝細胞Caspase-3激活；同時，糖酵解途徑關(guān)鍵酶3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）發(fā)揮催化反應(yīng)依賴NAD+同步還原為NADH，應(yīng)用SORD抑制劑有益于恢復NAD+/NADH的平衡，使葡萄糖更多地從糖酵解途徑代謝，增加ATP生成，逆轉(zhuǎn)I/R引起的能量虧損。故SORD抑制劑和AR抑制劑一樣也可能成為保護肝缺血/再灌注組織損傷的輔助方法[26]。

心肌細胞I/R早期，AR活性升高、山梨醇代謝旁路高激活，可通過抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）急性激活抑制內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EndMT），從而抑制心肌修復[27]。

2.3 腫瘤發(fā)生及侵襲性 在人結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌細胞系，AR表達降低，SORD表達上調(diào)，提示山梨醇代謝旁路可能與腫瘤發(fā)生過程的細胞代謝重構(gòu)有關(guān)[28]。目前尚缺乏細致的作用及機制研究。在NCL-60癌細胞系中基因陣列分析顯示，AR與上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）主要調(diào)節(jié)鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（ZEB1）密切相關(guān)；乳腺癌細胞系和肺癌細胞系在ZEB1敲除后AR也顯著減低。肺癌細胞系和卵巢癌細胞系抑制AR表達后，EMT及腫瘤生長均受到抑制，敲低SORD出現(xiàn)類似結(jié)果；高濃度葡萄糖致多元醇代謝旁路異常激活，后者刺激轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）相關(guān)信號通路，促進肺癌細胞系EMT[29]。

3 山梨醇代謝旁路與雄性生殖

在生殖系統(tǒng)，山梨醇代謝旁路也起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸支持細胞高表達AR，生精細胞不表達；生精細胞表達SORD，支持細胞不表達[4]。腎上腺中的AR能代謝膽固醇側(cè)鏈裂解副產(chǎn)物異己醛[12]，而睪丸精子發(fā)生過程中精子胞質(zhì)和脂質(zhì)膜的丟失過程需要處理膽固醇，故推測支持細胞高表達AR，主要功能是處理異己醛、脂醛等膽固醇代謝的副產(chǎn)物。

豬附睪液的葡萄糖、果糖不斷變化，在附睪頭較高、在附睪尾較低，而山梨醇濃度在附睪管中相對穩(wěn)定。附睪尾部低葡萄糖、果糖，可能是由于儲存于附睪的精子利用葡萄糖和果糖作為能量物質(zhì)而代謝所致；山梨醇在附睪管不同區(qū)段相對均勻分布，提示其可能參與維持附睪液滲透壓以維持精子頭部形態(tài)，而不是能量物質(zhì)[30]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，牛的附睪上皮細胞高表達AR、SORD，且附睪頭、體、尾AR和SORD的表達及活性存在差異，AR蛋白及酶活性在附睪尾部較低（相對于頭、體部），SORD蛋白和酶活性在附睪尾較高（相對于頭、體部），這有利于山梨醇向果糖轉(zhuǎn)化，而果糖更易于進入糖酵解產(chǎn)生能量，其為儲存在附睪尾的精子提供能量[31]。

不完全等同于牛的研究，人附睪頭、體、尾均表達AR和SORD，且在各區(qū)段相對均勻，主要出現(xiàn)于附睪上皮細胞的頂端。這種差異可能是人類附睪獨特的形態(tài)學特點所致，與牛相比，人類附睪尾發(fā)育不良，精子儲存能力低下，故附睪中山梨醇旁路可能發(fā)揮其他作用[5]。

山梨醇和果糖是人類、豬、大鼠、公羊精液的組成成分，為精子活動的能量來源之一[5,30]。人附睪小體和前列腺小體內(nèi)有AR和SORD表達，在牛附睪小體內(nèi)，AR為主要酶之一[5,31]。還有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠精子從附睪頭向尾運行時，附睪上皮細胞的AR會通過附睪小體轉(zhuǎn)移到精子上，這種“傳遞”具體作用尚不清楚，可能與精子活動有關(guān)[4]。

綜上，山梨醇代謝旁路可能參與精子發(fā)生過程和成熟過程：①支持細胞AR可能參與代謝與清除精子發(fā)生過程中膽固醇側(cè)鏈裂解所產(chǎn)生的有毒醛類；②附睪內(nèi)葡萄糖、山梨醇、果糖可能參與精子成熟和儲存，精液中山梨醇、果糖也是精子能量來源之一；③附睪小體、前列腺小體介導附性腺與精子之間的AR、SORD運輸，這種“傳遞”可能與精子活動有關(guān)。

4 山梨醇代謝旁路與雌性生殖

卵母細胞成熟過程有4種糖代謝的方式：糖酵解、磷酸戊糖途徑、己糖胺生物合成途徑和山梨醇代謝旁路[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞和顆粒細胞均有AR和SORD的表達，且卵母細胞通常高表達AR和SORD，表明山梨醇代謝旁路在卵母細胞發(fā)育與成熟中有某種重要作用[32]。

卵母細胞減數(shù)分裂恢復由中期促進因子（MPF）觸發(fā)[33]。卵母細胞MPF是由一個催化亞基和一個調(diào)節(jié)亞基組成的蛋白復合物，前者是細胞周期蛋白依賴的激酶1（Cdk 1），后者是細胞周期蛋白B1（cyclin B1）。卵泡刺激素（FSH）與顆粒細胞上的FSH受體結(jié)合，使卵母細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量激增，調(diào)控卵母細胞MPF的活性，對于恢復卵母細胞減數(shù)分裂很關(guān)鍵[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠中FSH不能有效刺激卵母細胞成熟[35]。那么，糖尿病小鼠卵母細胞對FSH低反應(yīng)性是否是由于山梨醇代謝旁路異常激活？有學者將正常小鼠和糖尿病小鼠的卵丘-卵母細胞復合物（COC）分別在含F(xiàn)SH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時添加不同濃度的山梨醇，比較生發(fā)泡破裂（GVBD）發(fā)生率，結(jié)果表明山梨醇以劑量依賴的方式抑制FSH誘導的減數(shù)分裂和卵母細胞成熟；正常小鼠和糖尿病小鼠的COC在含F(xiàn)SH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不添加外源性山梨醇，各自分別添加了AR抑制劑和AR激動劑，結(jié)果表明抑制AR后糖尿病小鼠COC被抑制的GVBD發(fā)生率得到改善，添加AR激動劑后正常小鼠COC的FSH促進GVBD作用被抑制，同時降低cAMP產(chǎn)生。提示了山梨醇代謝旁路對激素誘導的卵母細胞減數(shù)分裂具有抑制作用，因為山梨醇減少了FSH誘導的cAMP生成[6]。

奶牛子宮液含較高的山梨醇，低水平山梨醇可導致奶牛不孕[32]。研究發(fā)現(xiàn)，牛和大鼠的輸卵管局部存在差異表達的AR和SORD，作用尚不明確，可能與配子儲存、精子獲能并完成受精、早期胚胎發(fā)育等事件有關(guān)[36]。

Lin等[7]研究了山梨醇對豬早期胚胎發(fā)育的影響，在體外培養(yǎng)液中添加不同濃度的山梨醇，觀察其對豬卵母細胞成熟和囊胚形成的影響，并分析卵母細胞內(nèi)ROS和GSH含量，發(fā)現(xiàn)在添加較高濃度的山梨醇時，卵母細胞內(nèi)ROS增高，卵母細胞成熟率、卵丘細胞擴張均降低，囊胚形成率顯著降低，胚胎的細胞凋亡指數(shù)增加，說明較高濃度的山梨醇對卵母細胞質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育均有負面影響。Yamauchi等[8]發(fā)現(xiàn)，IVM培養(yǎng)液添加一定濃度山梨醇升高培養(yǎng)液的滲透壓，卵母細胞GVBD發(fā)生率降低，卵母細胞成熟減少。

因此，IVM培養(yǎng)液添加外源性山梨醇，可能通過三個方面影響卵母細胞成熟：①減少FSH誘導cAMP增高和新嘌呤合成；②減少GSH，增加卵母細胞ROS和氧化應(yīng)激；③升高了IVM培養(yǎng)液的滲透壓。

5 總結(jié)和展望

山梨醇代謝旁路的異常激活，與糖尿病慢性并發(fā)癥密切相關(guān)，已合成多種小分子AR抑制劑以對應(yīng)不同的糖尿病并發(fā)癥，如針對糖尿病眼病的索比尼爾（sorbinil）、針對糖尿病神經(jīng)病變的槲皮素（quercetin）等，抑制高血糖所致山梨醇代謝旁路異常激活，有望進入臨床用于預防和治療糖尿病慢性并發(fā)癥[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇代謝旁路在生殖系統(tǒng)也發(fā)揮重要作用，人和公羊、牛、豬等動物精液中山梨醇和果糖可作為精子活動的能量來源物質(zhì)，睪丸支持細胞AR參與清除精子發(fā)生過程的有毒代謝產(chǎn)物。在雌（女）性，山梨醇代謝旁路與卵母細胞成熟有關(guān)，在IVM培養(yǎng)液中添加較大濃度山梨醇對卵母細胞成熟產(chǎn)生負面影響，可能與減少FSH誘導的cAMP生成、提高卵母細胞內(nèi)ROS、升高培養(yǎng)液滲透壓等有關(guān)。研究山梨醇代謝旁路在生殖系統(tǒng)的作用，對于進一步闡明配子發(fā)生與成熟、提高IVM培養(yǎng)液效能具有重要意義。