胥 柯，郝蘭香，黃 飛，劉艷梅

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇鹽城 224000)

甲狀腺癌是臨床常見(jiàn)的一種內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，在我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1-2]。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是臨床診斷甲狀腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但只能確診70%～80%的甲狀腺癌患者[3]。目前尚無(wú)理想的蛋白標(biāo)志物用于臨床診斷甲狀腺癌，因而探討甲狀腺癌的的早期診斷標(biāo)志物顯得尤為必要[4]。近年來(lái)，細(xì)胞角蛋白19(CK19)、人骨骼內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(HBME-1)、鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1(BRAF)基因等分子標(biāo)志物或其組合已被建議用于臨床診斷甲狀腺癌，但這些標(biāo)志物的可靠性還存在較大的爭(zhēng)議[5-7]。本研究通過(guò)兩種不同的方法檢測(cè)甲狀腺癌患者的CK19、HBME-1表達(dá)水平以及BRAF基因突變情況，以期探討這些分子標(biāo)志物的可靠性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2016年4月至2017年4月收治的甲狀腺癌患者62例為研究對(duì)象，其中女32例，男30例；年齡46～65歲，平均(53.26±4.78)歲。選取同期收治的62例甲狀腺良性病變患者為對(duì)照，其中男29例，女33例；年齡48～64歲，平均(54.13±3.26)歲，兩組患者的年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。根據(jù)第7版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)癌癥分期手冊(cè)對(duì)甲狀腺癌進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期患者26例，Ⅱ期患者20例，Ⅲ期患者16例，腫瘤直徑0.82～1.54 cm，平均(1.13±0.32)cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前合并其他腫瘤，如髓樣癌、濾泡狀癌等；(2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)不完整。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有研究對(duì)象均簽署患者知情同意書(shū)。

1.2主要試劑 所用鼠抗人CK19、HBEM-1單克隆抗體(即用型)以及BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。DNA提取測(cè)試盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)所用試劑均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè) CK-19以及HBEM-1蛋白表達(dá)所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片(3 μm)及常規(guī)的HE染色。采用Envision兩步法對(duì)CK19和HBEM-1進(jìn)行免疫標(biāo)記，分別檢測(cè)62例甲狀腺癌患者組織和62例甲狀腺良性病變組織(對(duì)照)的CK19、HBME-1蛋白表達(dá)水平。具體的實(shí)驗(yàn)步驟按照操作步驟說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)過(guò)一系列的抗原修復(fù)、顯色、染色操作后，用中性樹(shù)脂封片，在顯微鏡下觀察。其中 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性參考來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)切片的染色情況。結(jié)果判定：采用雙盲法閱片，由2名病理科醫(yī)生評(píng)判計(jì)分。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒狀物質(zhì)為陽(yáng)性，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色數(shù)計(jì)分：陽(yáng)性數(shù)≥71%，3分；陽(yáng)性數(shù)36%～70%，2分；陽(yáng)性數(shù)6%～35%，1分；陽(yáng)性數(shù)≤5%，0分。依據(jù)著色強(qiáng)度計(jì)分：強(qiáng)著色(明顯的棕黃色)2分；弱著色(淡棕黃色)1分；不著色0 分。陽(yáng)性分級(jí)：兩項(xiàng)指標(biāo)分?jǐn)?shù)相加分為4級(jí)，1～2分(-)，3分(+)，4分(++)，5～6分(+++)，其中-表示陰性，+表示弱陽(yáng)性，++表示陽(yáng)性，+++表示強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性發(fā)生事件為+～+++之和，陽(yáng)性率(%)=陽(yáng)性事件數(shù)/總病例數(shù)×100%。

1.3.2PCR法及DNA測(cè)序法檢測(cè)BRAF基因突變 分別檢測(cè)62例甲狀腺癌患者和62例甲狀腺良性病變組織BRAF基因突變狀況。電鏡下觀察甲狀腺癌患者標(biāo)本組織的HE切片，選取腫瘤成分豐富的蠟塊，連續(xù)切5張3 μm厚白片，封存于EP管，二甲苯處理，蛋白酶K完全消化，嚴(yán)格依照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取石蠟組織標(biāo)本DNA，待測(cè)樣品、BRAF陰性以及陽(yáng)性質(zhì)控品分別加樣并配置反應(yīng)體系。應(yīng)用PCR擴(kuò)增組織標(biāo)本DNA的BRAF基因第15外顯子，而后在自動(dòng)化基因分析儀(購(gòu)自美國(guó)ABI公司)進(jìn)行測(cè)序。采用Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果，刪除不穩(wěn)定的測(cè)序區(qū)域后，將其后面的序列與野生型標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，標(biāo)記處為600(T1799A)位密碼子，AGC可能會(huì)發(fā)生A→C突變，即密碼子600的錯(cuò)義突變(V600E)。野生型核苷酸AGC TAC AGT GAA ATC TCG A，野生型氨基酸AGC KS；突變型核苷酸CGC TAC AGT GAA ATC TCG A，突變型氨基酸GCT KS。

2 結(jié) 果

2.1甲狀腺癌與甲狀腺良性病變組織CK19、HBME-1蛋白表達(dá) CK19陽(yáng)性表達(dá)部位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，62例甲狀腺癌患者標(biāo)本組織中CK19陽(yáng)性事件數(shù)為62例，陽(yáng)性表達(dá)率為100.0%，見(jiàn)圖1A，60例甲狀腺癌患者組織標(biāo)本中以陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為主。而甲狀腺良性病變組織CK19陽(yáng)性事件數(shù)為12例，其陽(yáng)性表達(dá)率為19.35%，主要以陰性和弱陽(yáng)性分級(jí)較多見(jiàn)，見(jiàn)圖1B。CK19在甲狀腺癌與甲狀腺良性病變組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。HBME-1陽(yáng)性表達(dá)部位多見(jiàn)于細(xì)胞膜，腺腔邊緣也有部分著色。甲狀腺良性病變組織中陽(yáng)性事件僅有4例，占總樣本的6.45%，剩下58例均為陰性表達(dá)，見(jiàn)圖1C。而62例甲狀腺癌患者標(biāo)本組織，陽(yáng)性事件數(shù)為60例，其陽(yáng)性表達(dá)率為96.77%，多數(shù)以陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性分級(jí)表達(dá)為主，見(jiàn)圖1D。HBME-1在甲狀腺癌與甲狀腺良性病變組織中HBME-1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2BRAF突變情況的分析 通過(guò)BRAF基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，62例甲狀腺癌患者中有37例BRAF基因發(fā)生突變，陽(yáng)性率為59.68%，BRAF突變?yōu)辄c(diǎn)突變，具體表現(xiàn)為15號(hào)外顯子1799位點(diǎn)，腺嘌呤替換為胞嘧啶(T1799A)。62例甲狀腺良性病變患者組織均沒(méi)有發(fā)生BRAF T1799A基因突變,突變率為0。在陽(yáng)性分級(jí)較低的Ⅰ和Ⅱ級(jí)中，BRAF的突變率分別為46.15%(12/36)和50.00%(10/20),在侵襲行為較高的陽(yáng)性分級(jí)到達(dá)Ⅲ級(jí)的甲狀腺癌組織中BRAF的突變率明顯提高，達(dá)到93.75(15/16)。當(dāng)腫瘤直徑≥1 cm時(shí)，BRAF的突變率達(dá)到78.26%(36/46)，直徑<1 cm時(shí)，BRAF的突變率明顯降低，突變率為6.25%(1/16)。

表1 兩組患者組織CK19、HBME-1表達(dá)差異比較[n(%)]

注：A表示甲狀腺癌組織CK19呈強(qiáng)陽(yáng)性；B表示甲狀腺良性病變組織CK19呈弱陽(yáng)性；C表示甲狀腺良性病變組織中HBME-1呈弱陽(yáng)性；D表示甲狀腺癌組織HBME-1呈強(qiáng)陽(yáng)性

圖1 甲狀腺癌與甲狀腺良性病變組織CK19、 HBME-1 免疫組織化學(xué)圖

表2 BRAF基因突變陽(yáng)性率與CK19、HBME-1以及其他臨床病理特征的關(guān)系

2.3Spearman相關(guān)分析 將甲狀腺癌患者BRAF基因突變與CK19、HBME-1表達(dá)、腫瘤分期以及腫瘤直徑等進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，BRAF基因突變陽(yáng)性率與腫瘤直徑、TNM分期呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，與CK19以及HBME-1陽(yáng)性表達(dá)率呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

3 討 論

CK19是一類(lèi)低分子量角蛋白，在多種上皮組織中均可表達(dá)[8]。近年來(lái)，相關(guān)研究結(jié)果表明，甲狀腺癌患者上皮組織中的CK19表達(dá)水平較高，陽(yáng)性率為70.00%～100.00%，而在甲狀腺良性病變組織的陽(yáng)性率不穩(wěn)定，沒(méi)有確切的陽(yáng)性表達(dá)[9]。這些研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者組織中的CK19表達(dá)率遠(yuǎn)高于甲狀腺良性病變患者組織，靈敏度高達(dá)100.00%[10]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者組織中的CK19陽(yáng)性率達(dá)100.00%，而甲狀腺良性病變患者的CK19陽(yáng)性率僅為19.35%，與上述研究結(jié)果一致。然而最近研究表明，CK19的特異性較低，導(dǎo)致臨床診斷甲狀腺癌使用CK19作為觀察指標(biāo)的作用受限，故而臨床診斷過(guò)程不能單獨(dú)依靠CK19陽(yáng)性診斷甲狀腺癌[11]。同時(shí)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中等以上強(qiáng)度的CK19陽(yáng)性表達(dá)對(duì)甲狀腺癌有較好的警惕性作用，說(shuō)明CK19具有一定的作用。

HBME-1是間皮細(xì)胞微絨毛表面特異性標(biāo)志物。因其在腫瘤血管的形成、腫瘤的生長(zhǎng)以及腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并且高表達(dá)于甲狀腺癌組織中，因此，可應(yīng)用于臨床診斷甲狀腺癌良惡性腫瘤。相關(guān)研究報(bào)道，HBME-1在甲狀腺癌組織和甲狀腺良性病變組織病變間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，特異度和靈敏度均較高[12]?？梢?jiàn)，HBME-1在用于甲狀腺癌的鑒別診斷時(shí)，是一項(xiàng)較為理想的標(biāo)志物。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若以特異度最高的HBME-1聯(lián)合CK-19蛋白作為臨床診斷甲狀腺癌的依據(jù)，可使病理診斷結(jié)果更加可靠。本研究結(jié)果中，HEME-1在甲狀腺癌組織中陽(yáng)性檢出率為96.77%，在甲狀腺良性病變組織中的陽(yáng)性檢出率6.45%，也說(shuō)明HEME-1在惡良性腫瘤中檢出的靈敏度較高。

BRAF位于7q34，是RAF基因家族成員之一，在MAPK信號(hào)通路中起重要作用。近年文獻(xiàn)報(bào)道，BRAF基因突變多發(fā)于甲狀腺癌患者組織，最多見(jiàn)的突變位點(diǎn)是15外顯子1799位點(diǎn)，該處的T被替代成A(T1799A)，導(dǎo)致編碼的蛋白產(chǎn)物發(fā)生改變，第600位本應(yīng)是纈氨酸結(jié)果變成了谷氨酸，致使基因介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)生了異常，但該突變僅見(jiàn)于甲狀腺癌和部分可能起源于甲狀腺癌的未分化癌患者[13]。國(guó)外相關(guān)研究報(bào)道表明，甲狀腺癌患者組織中的BRAF基因15外顯子1799位點(diǎn)突變率多在30%～45%，而國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道甚少[14-15]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺良性病變患者組織沒(méi)有1例發(fā)生BRAF基因突變，而甲狀腺癌患者多達(dá)37例發(fā)生BRAF T1799A突變，與國(guó)外報(bào)道相似，表明BRAF基因突變可能是甲狀腺癌發(fā)生的一項(xiàng)重要事件，有利于臨床早期診斷甲狀腺癌。但與國(guó)外研究的結(jié)果有所不同，本研究中的BRAF T1799A突變率略高于國(guó)外水平，其可能原因是與環(huán)境因素有關(guān)。BRAF基因突變與CK19、HBME-1表達(dá)水平存在顯著正相關(guān)，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變與臨床病理參數(shù)(TMN分期、腫瘤直徑)存在顯著負(fù)相關(guān)，再次表明BRAF基因突變以及CK19、HBEM-1可作為臨床診斷甲狀腺癌的指標(biāo)。

4 結(jié) 論

本研究首次探討了甲狀腺癌發(fā)生過(guò)程中BRAF基因突變與CK19和HBME-1分子表達(dá)間的相關(guān)性，結(jié)果表明將BRAF基因突變與CK19和HBEM-1進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)對(duì)甲狀腺癌發(fā)生的診斷具有較高的臨床價(jià)值，可作為臨床診斷指標(biāo)。