馬凱旋，劉建學(xué)，2，*，韓四海，2，李璇，2，李佩艷，2，徐寶成，2，羅登林，2

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南洛陽471023）

近年，食品安全問題惡性事件在全球范圍頻頻爆發(fā)，無論是發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，都面臨著食品安全問題。由食源性致病菌引起食品中毒事件的發(fā)生率在全球范圍內(nèi)占很大比重，對(duì)人類健康造成極大的危害，是隱藏在我們生活中的重大隱患[1-3]。然而隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和新技術(shù)、化學(xué)品的廣泛應(yīng)用，新的食源性疾病不斷出現(xiàn)，食品安全的形勢(shì)變得更加嚴(yán)峻，如何快速高效地檢測(cè)食源性致病菌已成為近年來的研究熱點(diǎn)。

近紅外光譜分析技術(shù)具有高靈敏性、指紋特征、分析速度快，在對(duì)食源性致病菌進(jìn)行鑒別時(shí)，樣品的前處理至關(guān)重要，因此有必要對(duì)近紅外光譜技術(shù)用于致病細(xì)菌分類鑒別的影響因素進(jìn)行探究[4-6]。在細(xì)菌的培養(yǎng)過程中，不同的培養(yǎng)條件可能會(huì)影響代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，直接引起樣品近紅外譜圖的變化。由吳海[7]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌在不同的pH值培養(yǎng)以及黑曲霉菌在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下，對(duì)所采集的紅外光譜圖進(jìn)行分析、比較，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)環(huán)境下的微生物譜圖雖然有重現(xiàn)性，但也存在可以用肉眼直接觀察到的譜帶差異，這種譜帶差異是否可以通過化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法進(jìn)行區(qū)分作者并未進(jìn)行研究。

細(xì)菌在不同的生長(zhǎng)期階段對(duì)培養(yǎng)液的利用情況存在差異性，且代謝特征也不同，從而其所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也必然不同[8]。陳麗萍等[9]利用PEN3電子鼻化學(xué)傳感器對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，研究了細(xì)菌在培養(yǎng) 2、4、6、8、10 h 后所產(chǎn)生的氣體成分具有差異性，這種差異主要是細(xì)菌在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間，對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用情況不同，所產(chǎn)生的氣味在電子鼻傳感器上呈現(xiàn)不同的響應(yīng)信號(hào)。近紅外光譜技術(shù)能否對(duì)這些差異識(shí)別出來，尚缺乏相關(guān)研究。目前研究都是直接對(duì)食源性致病菌進(jìn)行分類鑒別，對(duì)細(xì)菌在不同培養(yǎng)條件下的光譜進(jìn)行比較，沒有對(duì)培養(yǎng)條件的不同是否會(huì)影響近紅外光譜技術(shù)對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行研究。雖然光譜的預(yù)處理可以減少噪聲和樣品量不同所產(chǎn)生的差異，但近紅外光譜技術(shù)能否完全消除濃度間的差異尚缺乏試驗(yàn)驗(yàn)證，這對(duì)樣品制備及結(jié)果分析至關(guān)重要。因此，本文針對(duì)此問題探究不同濃度、不同培養(yǎng)階段等對(duì)近紅外光譜技術(shù)用于細(xì)菌分類鑒別的影響。這將會(huì)為近紅外光譜技術(shù)廣泛用于細(xì)菌分類、鑒定及檢測(cè)提供重要的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸埃希氏菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；單增李斯特菌：河南省洛陽市疾病預(yù)防與控制中心；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星公司；0.9%生理鹽水、氯化鈉：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VECTOR-33型傅里葉變換近紅外光譜儀：德國(guó)Bruker公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；YXQ-LS-50S型自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHP-9420A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HYL-A全溫?fù)u瓶柜：太倉(cāng)市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ型超凈工作臺(tái)：蘇州安凈凈化科技有限公司；SZ93-1型自動(dòng)雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 不同濃度樣品制備

取-80℃保藏的菌種放置室溫，無菌操作吸取大腸埃希氏菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌各1 mL于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，蘸取菌液接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)使其復(fù)蘇，挑取純化培養(yǎng)后的單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其OD600，用于估計(jì)菌液濃度。

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液在4℃，5 000 r/min，10 min的高速冷凍離心機(jī)分離菌體，用0.9%生理鹽水洗滌兩次，再用蒸餾水洗滌一次，離心后舍棄上清液，用10 mL 0.9%生理鹽水洗滌沉淀部分，充分振蕩使菌體均勻分布，將菌液進(jìn)行梯度稀釋103、105、107倍，對(duì)應(yīng)菌落數(shù)分別為 105、103、10 CFU/mL。每個(gè)樣品做4個(gè)平行，每個(gè)平行做3次重復(fù)。

1.3.2 不同培養(yǎng)階段樣品制備

于37℃下接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，180 r/min振蕩培養(yǎng)至各細(xì)菌的延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其OD600，用于估計(jì)菌液濃度。將各時(shí)期培養(yǎng)后的菌懸液在4℃，5 000 r/min，10 min的高速冷凍離心機(jī)分離菌體，用0.9%生理鹽水洗滌兩次，再用蒸餾水洗滌一次，離心后舍棄上清液，用10 mL 0.9%生理鹽水洗滌沉淀部分，充分振蕩使菌體均勻分布。每個(gè)樣品做4個(gè)平行，每個(gè)平行做3次重復(fù)。

1.3.3 檢測(cè)樣品近紅外光譜的采集

在溫度25℃、濕度60%左右條件下，利用VECTOR-33型傅里葉變換近紅外光譜儀采集樣品的透射光譜圖。以空白比色皿作為光譜的背景采集，掃描范圍12 000 cm-1～4 000 cm-1，分辨率 8 cm-1，掃描次數(shù) 32 次。

1.3.4 光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理及數(shù)據(jù)分析

利用The Unscrambler X10.4分析軟件對(duì)不同濃度、不同培養(yǎng)階段的3種致病菌所采集的近紅外譜圖，進(jìn)行Savitzky-Golay卷積平滑、矢量歸一化等預(yù)處理。其目的主要是：近紅外原始光譜波段中存在大量與樣本自身性質(zhì)無關(guān)的冗余和噪聲信息，會(huì)影響后續(xù)數(shù)據(jù)的分析，所以需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，以消除在試驗(yàn)或者檢測(cè)過程中易受到樣品采集量、采集光譜的環(huán)境所造成光譜漂移、傾斜現(xiàn)象等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾[10-11]。

主成分分析[12-13]（principal component analysis，PCA）是一種較為成熟的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，是數(shù)據(jù)壓縮和特征信息提取技術(shù)。運(yùn)用PCA方法可以減少數(shù)據(jù)維數(shù)，轉(zhuǎn)換原變量，并且不會(huì)降低光譜間的差異信息，這類分析方法可在事先未知類別的情況下對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

將預(yù)處理后的不同濃度、不同培養(yǎng)階段致病菌12 000 cm-1～4000 cm-1波數(shù)范圍的光譜數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入MATLAB R2014a軟件，進(jìn)行主成分分析分別得到不同濃度、不同培養(yǎng)階段近紅外光譜的主成分聚類分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌的濃度對(duì)近紅外分類鑒別的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸埃希氏菌O157∶H7、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌分別稀釋103、105、107倍，不同稀釋度的3種致病菌近紅外透射平均光譜圖見圖1所示。

利用The Unscrambler X10.4軟件分別對(duì)其進(jìn)行Savitzky-Golay卷積平滑、矢量歸一化等預(yù)處理，能在一定程度上消除因噪聲和樣品量不同產(chǎn)生的光譜差異。由圖1可以看出，這3種致病菌的不同稀釋度近紅外圖譜的差異性初步體現(xiàn)出來，但仍無法將不同稀釋度的3種致病菌很好的區(qū)分。因此需要先進(jìn)行數(shù)學(xué)預(yù)處理，提取特征光譜信息，采用主成分分析法作進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理。經(jīng)預(yù)處理后，將3種致病菌不同稀釋度的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，匯于表1，得到3種致病菌PC1、PC2的累積貢獻(xiàn)率，通常主成分的累積貢獻(xiàn)率超過85%以上即可使用[14]。

圖1 3種致病菌不同稀釋度的近紅外透射平均光譜圖Fig.1 Near infrared transmission average spectrum of three kinds of pathogenic bacteria with different dilutions

表1 3種致病菌的PCA累積貢獻(xiàn)率Table 1 PCA cumulative contribution rate of three pathogenic bacteria

由表1可知，3種致病菌不同濃度的累積貢獻(xiàn)率均在90%以上，解釋了原始變量的大部分信息，所以采用具有代表性的前2個(gè)主成分建立聚類分布模型。以主成分 1（PC1）和主成分 2（PC2）作為聚類依據(jù)，主成分聚類分布結(jié)果見圖2、圖3、圖4所示。

圖2 大腸埃希氏菌O157∶H7不同濃度的PCA聚類分布圖Fig.2 PCA cluster distribution drawing of E.coli O157：H7 at different concentrations

圖3 單增李斯特菌不同濃度的PCA聚類分布圖Fig.3 PCA cluster distribution drawing of Listeria monocytogenes at different concentrations

圖4 金黃色葡萄球菌不同濃度的PCA聚類分布圖Fig.4 PCA cluster distribution drawing of Staphylococcus aureus at different concentrations

通過PCA分析3種致病菌不同濃度的菌液，可觀察到各自分析數(shù)據(jù)點(diǎn)分布較為集中，沒有重疊。試驗(yàn)結(jié)果表明近紅外光譜對(duì)致病菌的響應(yīng)較為靈敏，主成分分析的區(qū)分度較強(qiáng)，在稀釋107倍較低濃度下仍能對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。由此可知，近紅外光譜技術(shù)對(duì)致病菌的濃度比較敏感，盡管對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，能在一定程度上消除光譜的差異，但這并非絕對(duì)。較大的濃度差異將會(huì)影響近紅外光譜技術(shù)對(duì)致病菌的檢測(cè)結(jié)果。因此在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，樣品濃度這一指標(biāo)不可忽視，應(yīng)統(tǒng)一樣品的濃度，減少后期數(shù)據(jù)分析的難度。

2.2 致病菌的不同培養(yǎng)階段對(duì)近紅外分類鑒別的影響

3種致病菌培養(yǎng)至各細(xì)菌的延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期的近紅外透射平均光譜圖見圖5。

圖5 3種致病菌不同培養(yǎng)階段的近紅外透射平均光譜圖Fig.5 Near infrared transmission average spectrum of three kinds of pathogenic bacteria with different culture phases

由圖5可以看出，這3種致病菌的不同培養(yǎng)階段間近紅外譜圖的整體趨勢(shì)非常接近，說明所含物質(zhì)的基團(tuán)是相似的，對(duì)光譜的吸收峰位差異極小，無法用肉眼直接區(qū)分。經(jīng)預(yù)處理后，將3種致病菌不同培養(yǎng)階段的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，匯于表2，得到3種致病菌PC1、PC2的累積貢獻(xiàn)率。

由表2可知，不同培養(yǎng)階段3種致病菌的累積貢獻(xiàn)率均在95%以上，解釋了原始變量的大部分信息，所以采用前2個(gè)主成分建立聚類分布模型具有代表性。將不同培養(yǎng)階段的3種致病菌進(jìn)行PCA分析，聚類分布結(jié)果如圖6、7、8所示。

表2 3種致病菌的PCA累積貢獻(xiàn)率Table 2 PCA cumulative contribution rate of three pathogenic bacteria

圖6 大腸埃希氏菌O157∶H7不同培養(yǎng)階段的PCA聚類分布圖Fig.6 PCA cluster distribution drawing of E.coli O157：H7 at different culture phases

圖7 單增李斯特菌不同培養(yǎng)階段的PCA聚類分布圖Fig.7 PCA cluster distribution drawing of Listeria monocytogenes at different culture phases

圖8 金黃色葡萄球菌不同培養(yǎng)階段的PCA聚類分布圖Fig.8 PCA cluster distribution drawing of Staphylococcus aureus at different culture phases

3種致病菌不同培養(yǎng)階段的分析數(shù)據(jù)點(diǎn)各自位于一定的區(qū)域范圍，分布較為集中，無重疊部分并且PCA累積貢獻(xiàn)率較高，說明近紅外光譜技術(shù)對(duì)致病菌的檢測(cè)受不同培養(yǎng)階段的影響。由于不同屬的細(xì)菌菌體所具有的酶系統(tǒng)不同，從而分解能力差別較大，在同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間，對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用情況和所產(chǎn)生的產(chǎn)物就會(huì)不同，揮發(fā)物的濃度亦有差異，其所對(duì)應(yīng)的光譜特征也不盡相同。檢測(cè)結(jié)果表明近紅外光譜技術(shù)可以將同一細(xì)菌的不同培養(yǎng)階段進(jìn)行區(qū)分。可能的原因是：近紅外光譜反映的是整個(gè)細(xì)胞組分的化學(xué)鍵振動(dòng)情況，由于不同培養(yǎng)階段的細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生的代謝成分不同，通過對(duì)近紅外的特異吸收將其有效的區(qū)分。

3 結(jié)論

近紅外光譜技術(shù)具有高靈敏性，在致病菌檢測(cè)中對(duì)樣品的前處理至關(guān)重要，不同培養(yǎng)條件會(huì)使細(xì)菌的代謝特征發(fā)生變化，從而影響近紅外光譜的變化并造成檢測(cè)結(jié)果的誤差。在樣品的制備過程，光譜采集及數(shù)據(jù)的處理須嚴(yán)謹(jǐn)、規(guī)范。通過對(duì)不同培養(yǎng)條件的光譜分析進(jìn)行驗(yàn)證，由PCA分析結(jié)果可知：細(xì)菌濃度、培養(yǎng)時(shí)間均會(huì)干擾致病菌的近紅外譜圖并影響檢測(cè)結(jié)果。因此，在應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對(duì)致病菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品的濃度、培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)一，減少后續(xù)數(shù)據(jù)分析的難度，提高鑒別的準(zhǔn)確度。