劉梅，黃治國，衛(wèi)春會，鄧杰，謝軍

（四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

中國白酒具有酒體透明、清澈純凈、口感協(xié)調(diào)、芳香四溢、入口爽凈、飲后回味悠久等特點[1]。中國濃香型白酒的發(fā)酵設(shè)備為全泥窖池，窖泥是其發(fā)酵設(shè)備的核心“部件”，通過長期的馴化，窖泥逐漸形成一個穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，都是有利于釀酒的微生物，其中包括多種霉菌、酵母菌、細(xì)菌、放線菌等，是一個“群微共酵”的完整微生物體系[2]。因此窖泥是包括酵母、己酸菌、甲烷菌等釀酒功能菌株的良好來源[3-5]。

濃香型白酒生產(chǎn)中，酵母自溶可為發(fā)酵微生物提供營養(yǎng)及香味的前體物，提高己酸活菌數(shù)及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[6-8]。莊名揚(yáng)等曾在醬香型酒高溫堆積糟里分離出幾株具有一定發(fā)酵能力的酵母，其發(fā)酵液呈現(xiàn)出不同香味，同時，在意大利酵母的作用下產(chǎn)生濃郁的芝麻香[9]。龐博于白酒酒醅中篩選出的酵母（Pichia ku-driavzevii）表現(xiàn)出較強(qiáng)香味物質(zhì)生產(chǎn)能力[10]。唐潔等通過麩皮汁培養(yǎng)基利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）進(jìn)行混菌發(fā)酵，表明混菌發(fā)酵能夠形成更多的酯類物質(zhì)[11]。

響應(yīng)面優(yōu)化法廣泛應(yīng)用于食品，生物，環(huán)境等各方面[12-16]，為此本試驗通過篩選白酒窖泥中產(chǎn)酯性能較好的菌株，利用響應(yīng)面法優(yōu)化其增殖培養(yǎng)條件，為釀造優(yōu)質(zhì)白酒提供產(chǎn)酯酵母來源和一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

窖泥樣品來自川南某白酒廠生產(chǎn)老窖池，所取樣品用塑封袋密封后，迅速置于低溫取樣盒中，冷藏運(yùn)回，于4℃保存待用。

酵母菌分離培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）：葡萄糖 20 g，酵母膏 10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min[17]。

酵母菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5g，硫酸銨0.5g，酵母膏1g，蒸餾水1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min[17]。

乙酸丁酯（色譜純）、葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、酵母膏（分析純）：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺：江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；ZWYR-D2403恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；GC7890-5975MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酯酵母菌株的初篩

稱取0.5 g窖泥加入到裝有49.5 mL滅菌生理鹽水的三角燒瓶中，振蕩培養(yǎng)2 h，吸取培養(yǎng)液1 mL，進(jìn)行不同濃度梯度稀釋，分別取0.2 mL涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)48 h，選擇具有酵母菌菌落特征的單菌落進(jìn)行劃線[18]，并純化3次。由10位身體健康，無不良嗜好、偏食和變態(tài)性反應(yīng)[19]的同學(xué)組成評價小組，對發(fā)酵后的酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行外觀及氣味的評價，綜合評價，挑選出產(chǎn)酯能力較好的酵母菌。

1.3.2 產(chǎn)酯酵母菌株的復(fù)篩

酵母液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d，發(fā)酵結(jié)束后，取5 mL發(fā)酵樣品進(jìn)行頂空液相微萃取，利用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographic-mass spectrometry，GC-MS）對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析。

頂空固相微萃?。阂埔簶寽?zhǔn)確吸取5 mL液態(tài)發(fā)酵樣品及60 μL 20 mg/100 mL的乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)于頂空瓶中，振蕩搖勻，將頂空瓶放入全自動固相微萃取儀中，55℃平衡15 min，將已老化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取30 min，解吸6 min。

色譜條件：色譜柱（DB-WAX，60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣，進(jìn)樣口溫度 250℃，分流比為20∶1，升溫程序：初始溫度45℃，保持1min，以6℃/min升至180℃，保持2 min，再以20℃/min升至230℃，保留5 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度240℃，離子源溫度200℃，離子化方式EI，電子能量70 eV，全掃描。

內(nèi)標(biāo)法[20]（假定各組分的響應(yīng)因子為1）計算公式為：mi=（ms/As）×Ai

式中：mi為組分的質(zhì)量；ms為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；Ai為組分的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.3.3 酵母菌生長性能檢測

生物量檢測法：采用恒重法[21-22]。

1.3.4 菌株鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法和酶解法相結(jié)合提取菌株DNA，對5.8S ITS區(qū)段進(jìn)行序列擴(kuò)增，測序委托擎科生物有限公司完成，得到序列結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行同源序列檢索，將目標(biāo)菌株與較高同源性菌株作同源性比較分析[23]。

1.3.5 酵母增殖培養(yǎng)條件優(yōu)化1.3.5.1 單因素試驗

初始培養(yǎng)條件為：溫度為28℃、pH值為6.5、培養(yǎng)時間為3 d、接種量為3%、錐形瓶規(guī)格為100 mL（50%）、種子液為培養(yǎng)4 d的菌懸液，轉(zhuǎn)速為120 r/min。分別對溫度、pH值、培養(yǎng)時間、接種量、裝液量、接種種齡、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗，其中溫度分別為28、31、34、37℃和 40 ℃；pH 值分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；生長時間分別為 2、3、4、5 d和 6 d；接種量分別為 1%、2%、3%、4%、5%和6%；裝液量分別為10%、20%、30%、40%、50%；接種種齡為 2、3、4、5 d 和 6 d；培養(yǎng)轉(zhuǎn)速梯度為60、90、120、150、180 r/min。每組試驗做 3 個平行，通過恒重法反映菌體生長情況。

1.3.5.2 Plackett-Burman設(shè)計

Plackett-Burman試驗設(shè)計可以通過較少的試驗從眾多影響因素中篩選出具有顯著影響的因素[24-26]。以前期單因素試驗為基礎(chǔ)，本試驗選用 N=12的Plackett-Burman設(shè)計對7個因素（裝液量、培養(yǎng)時間、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、pH值、接種種齡）進(jìn)行考查，每個因素取+1和-1兩個水平[27]，因此本試驗取相鄰兩個梯度的值作為+1和-1兩個水平，響應(yīng)值為酵母菌細(xì)胞干重Y（g/L），得到的編碼水平如表1所示，用軟件Minitab17處理試驗數(shù)據(jù)，比較各因素的t值和可信度。

表1 部分因子試驗設(shè)計的因子和水平Table 1 Experimental factors and their levels of the 2-level factorial design

1.3.5.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，對達(dá)到顯著水平的影響因素設(shè)定步長及變化方向，逼近最佳區(qū)域。其他因素根據(jù)其對應(yīng)的效應(yīng)系數(shù)的正負(fù)和大小確定，找到響應(yīng)值最高的條件，作為下一步響應(yīng)面分析的中心點。

1.3.5.4 響應(yīng)面分析試驗方法

根據(jù)1.3.5.3的試驗結(jié)果,確定裝液量、培養(yǎng)溫度和接種種齡3個因素取值的中心點，中心點作為零水平。利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗及數(shù)據(jù)分析。以裝液量、培養(yǎng)溫度和接種種齡3個影響因素為自變量得到的編碼水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗因素編碼水平Table 2 Box-Behnken test factor coding level

1.3.5.5 酵母菌增殖結(jié)果驗證

將預(yù)測的最佳響應(yīng)值按所得條件重復(fù)3次試驗進(jìn)行驗證[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

從濃香型白酒窖泥中分離出9株酵母菌，編號為NJ-1至NJ-9，分別劃線于固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，對其結(jié)果進(jìn)行聞評見表3。

試驗篩選到的酵母菌產(chǎn)酯情況各異，其中NJ-1、NJ-2、NJ-8號菌株產(chǎn)酯能力相對較強(qiáng)，并且無明顯異味出現(xiàn)，可作為本次試驗初篩所得菌株，進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

本試驗研究初篩所得3株酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)酯能力的差異見圖1。

表3 酵母菌感官風(fēng)味評定Table 3 Sensory flavor assessment of yeast

圖1 NJ-1、NJ-2、NJ-8號菌株總酯含量圖Fig.1 Total ester content of strain NJ-1，NJ-2，NJ-8

由圖1可知：菌株NJ-8產(chǎn)酯量為239.7 mg/L，顯著高于其他兩株菌（P＜0.05），酯類產(chǎn)物有乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯，其中乙酸乙酯作為主要酯類，含量為148.052 5 mg/L，由于該菌株的產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，種類豐富，具有較高的研究價值。因此對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到更高的產(chǎn)酯量。

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

DNA采用CTAB法和酶解法相結(jié)合提取，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain readion，PCR）擴(kuò)增，提取和擴(kuò)增效果見圖2。

圖2 菌株NJ-8的DNA電泳圖、PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The DNA electrophoresis of strain NJ-8，the PCR product electrophoresis of the strain NJ-8

將提取DNA產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，于紫外燈下照射，出現(xiàn)目的條帶，則DNA提取成功，由圖2A可知該試驗DNA提取成功。5.8S rDNA的PCR擴(kuò)增：采用50μL反應(yīng)體系，用ITSl和ITS4對5.8S ITS區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min，95 ℃ 60 s，54 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72℃末端延伸5 min。由圖2B可知菌株NJ-8的PCR擴(kuò)增條帶為589 bp，位于500 bp～750 bp之間，可知該試驗5.8S rDNA的PCR擴(kuò)增成功。

將測序獲得的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對，采用MEGA6.0中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果見圖3。

圖3 菌株NJ-8的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NJ-8

由圖3可知其與Wickerhamomyces anomalus同源性為100%，初步確定菌株NJ-8為異常畢赤酵母。

2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗結(jié)果

外部發(fā)酵條件對細(xì)胞的生長和繁殖息息相關(guān)，如培養(yǎng)時間的長短直接影響菌株的生長繁殖，與其培養(yǎng)液營養(yǎng)成分的高低存在直接聯(lián)系；培養(yǎng)溫度過高通常會引起細(xì)胞膜流動性的變化，對于酵母菌而言，通常通過改變它的脂肪酸組成來適應(yīng)這一變化，對其生長繁殖產(chǎn)生直接或間接的影響[3]；種齡代表菌株初始出發(fā)菌的狀態(tài)，是否是其最佳增殖的生長時期；轉(zhuǎn)速、裝液量等影響菌株生長環(huán)境中的含氧量，與營養(yǎng)物的接觸面積及其對營養(yǎng)成分的吸收等，因此裝液量、培養(yǎng)時間、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、pH值以及接種種齡均是酵母菌生長的重要條件，對其增殖生長有及其重要的影響。外部發(fā)酵條件對細(xì)胞生長的影響情況見圖4～圖10。

圖4 裝液量對細(xì)胞干重的影響Fig.4 Effect of liquid loading on dry weight of cell

圖5 培養(yǎng)時間對細(xì)胞干重的影響Fig.5 Effect of culture time on dry weight of cells

圖6 接種量對細(xì)胞干重的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on dry weight of cells

圖7 培養(yǎng)溫度對細(xì)胞干重的影響Fig.7 Effect of temperature on dry weight of cells weight of cells

圖8 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對細(xì)胞干重的影響Fig.8 Effect of fermentation speed on cell dry weight

由圖4～圖10可知，本試驗通過單因素試驗得出酵母擴(kuò)培的培養(yǎng)條件為：裝液量10%，培養(yǎng)時間5 d，接種量5%，培養(yǎng)溫度34℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH 8.0，接種種齡 2 d。

圖9 pH值對細(xì)胞干重的影響Fig.9 Effect of pH on dry weight of cells

圖10 種齡對細(xì)胞干重的影響Fig.10 Effect of seed age on dry weight of cells

2.4.2 Plackett-Burman設(shè)計試驗結(jié)果

本研究選用N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，針對7個發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)選，以單因素結(jié)果作為出發(fā)點，Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，試驗各因素效應(yīng)系數(shù)見表5。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and result of Plackett-Burman

對試驗結(jié)果產(chǎn)生正效應(yīng)的因素為接種量、pH值、轉(zhuǎn)速、種齡，產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的因素為裝液量、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度。

表5 Plackett-Burman方差分析結(jié)果Table 5 Result of Plackett-Burman variance analysis

由表5可知，接種種齡、培養(yǎng)溫度和裝液量對酵母菌細(xì)胞干重的影響最大，可作為最陡爬坡試驗對象。

2.4.3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

由表5中各因素的效應(yīng)系數(shù)合理的確定最陡爬坡試驗的方向和步長，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and result of steepest climbing test

由表6可知，第2組試驗中酵母菌細(xì)胞干重最高，即裝液量為10%，培養(yǎng)溫度為32℃，接種的種齡為60 h時，酵母菌細(xì)胞干重為6.29 g/L。因此，依據(jù)第2組的試驗條件作為后續(xù)試驗的中心點進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.4.4 Box-Behnken試驗設(shè)計及分析結(jié)果

響應(yīng)面試驗法在多變量體系優(yōu)化和因素交互作用對響應(yīng)值的影響方面明顯優(yōu)于正交試驗，通過構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，經(jīng)過回歸分析和方差分析，可用于尋找最優(yōu)參數(shù)組合，其中Box-Behnken試驗設(shè)計是最有效的響應(yīng)面優(yōu)化法之一[29-31]。

Y作為響應(yīng)值，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，其中析因部分試驗12次，中心點重復(fù)試驗次數(shù)為5次。試驗設(shè)計及結(jié)果如表7所示。

利用Design-Expert軟件對BBD試驗設(shè)計的試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立以Y值為響應(yīng)值的全變量編碼水平的二次回歸方程如下：Y=6.12-0.26A-0.047B-0.11C-0.12AB+0.063AC-0.12BC+0.21A2+0.09B2-0.21C2，該模型極顯著（P＜0.01）。由回歸方程的決定系數(shù)R2=0.958 3可知，該二階回歸方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小。由表8可知，本試驗精密度達(dá)到15.672，大于4.0，即試驗設(shè)計及結(jié)果完全合理，說明試驗方法的可信度和精確度較好。

表7 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and result of Box-Behnken test

表8 BBD試驗方差分析結(jié)果Table 8 Result of BBD test variance analysis

2.4.5 顯著因素水平的優(yōu)化

響應(yīng)面是中心組合設(shè)計中的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，其他重要因素分別為水平面上的兩垂直橫坐標(biāo)構(gòu)成的三維模型[32]。三維響應(yīng)面圖可以更為直觀的反映其中兩因素的交互作用，影響顯著的模型曲面，其等高線呈橢圓形；反之，則等高線呈圓形[33]。

為了更直觀反映裝液量、培養(yǎng)溫度和接種種齡之間的交互作用對細(xì)胞干重的影響，利用Design-Expert軟件繪制出響應(yīng)面見圖11。

圖11 裝液量、培養(yǎng)溫度和接種種齡三因素交互作用對細(xì)胞干重的影響Fig.11 Effect of interaction of three factors on dry weight of cells：liquid content，culture temperature and inoculation age

回歸模型存在穩(wěn)定點（A裝液量、B培養(yǎng)溫度、C接種種齡）的編碼值為（1、-1、0.18），自變量和編碼變量之間的變換公式為xi=（Xi-X0）/△，公式中：△為自變量步長；xi為自變量編碼值；Xi為自變量實際值；X0為自變量在中心處實際值。即裝液量為11%，培養(yǎng)溫度為31℃及接種種齡為60.72 h時Y綜合值的最大估計值為6.33 g/L。

2.4.6 優(yōu)化結(jié)果的驗證試驗及結(jié)果

為了驗證優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對酵母細(xì)胞干重的效果，以原培養(yǎng)條件作為對照進(jìn)行驗證試驗。發(fā)現(xiàn)用優(yōu)化條件培養(yǎng)的細(xì)胞干重達(dá)（6.37±0.06）g/L，與該模型的預(yù)測值6.33 g/L接近，而未優(yōu)化培養(yǎng)的酵母菌細(xì)胞干重為（2.86±0.07）g/L，優(yōu)化后的細(xì)胞干重提高了約1.2倍，有明顯的提高效果，證明該模型有效。

3 討論與結(jié)論

中國白酒發(fā)酵是多種微生物同時進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的一個復(fù)雜過程，酵母起著重要作用，協(xié)同釀酒酵母發(fā)酵可以明顯增酯[34]。異常畢赤酵母能耐受較為極端的環(huán)境，如低pH值、高滲透壓、厭氧等，能夠誘導(dǎo)酒精發(fā)酵，激活發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵酶，能增加乙醇和乙酸乙酯等代謝物含量[35-36]；胡沂淮等從大曲中篩得一株生香異常畢赤酵母，采用GC-MS技術(shù)檢測葡萄糖發(fā)酵液的香氣成分，表明其風(fēng)味組分多達(dá)27種，分析這些香氣的組分，對生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義[37]；蒲春從大曲中篩選到8株產(chǎn)酯酵母，其中酶活最高的菌株為異常畢赤酵母，其酵母麩曲的酯化力可達(dá)到19.36 mg/100 mL[38]，可見異常畢赤酵母具有很高的研究價值。

本試驗以濃香型白酒釀造的窖泥為分離材料，采用平板涂布，挑取單菌落的傳統(tǒng)方法分離出一株產(chǎn)酯能力較好的酵母菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，為異常畢赤酵母。結(jié)合單因素和響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化該酵母擴(kuò)培的條件，了解到該菌株在裝液量為11%，培養(yǎng)溫度為31℃，培養(yǎng)時間5 d，接種量5%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH值8.0，接種種齡60.72 h的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞干重達(dá)6.37 g/L，是初始培養(yǎng)條件的222.7%，其培養(yǎng)條件的優(yōu)化達(dá)到了顯著的增殖效果，為釀造優(yōu)質(zhì)白酒提供產(chǎn)酯酵母來源和一定的技術(shù)參考。