趙優(yōu)萍，肖金妮，孫盧狄，蔡成崗，2，3，沙如意，2，3，方晟，毛建衛(wèi)，2，3，*

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江杭州310023；4.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，浙江紹興312000）

紫蘇是一種藥食兩用的唇形科紫蘇屬草本植物，原產(chǎn)于中國，種植面十分廣泛。紫蘇籽是紫蘇的種子，含油量45%～55%[1]。紫蘇籽油的不飽和脂肪酸含量達90%，其中含58.48%～76.18%的亞麻酸、8.53%～13.02%的亞油酸、11.42%～23.06%的油酸以及少許的棕櫚酸、硬脂酸等[2-4]。近些年來，隨著科技的發(fā)展和可用資源的稀缺，國內(nèi)外對紫蘇籽油進行了深入研究，不少紫蘇籽油產(chǎn)品已投入市場，市場反饋良好。紫蘇籽油不僅提供了人體必需的脂肪酸，同時因其具有抗衰老、抗癌、促進大腦發(fā)育、增強記憶力、保護視力、降血脂等功效[5-8]，也被視為一款保健品，市場前景十分廣泛。

目前，紫蘇籽油提取工藝有機械壓榨法、溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法和亞臨界萃取法等[9-13]。在新型提取方式方面，馬娜等[14]對紫蘇籽油不同提取方法的比較研究發(fā)現(xiàn)，利用超聲波輔助超臨界CO2提取紫蘇籽油中總脂肪含量為46.90%，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的39%，α-亞麻酸占不飽和脂肪酸的61.57%。彭維等[15]研究了超臨界和亞臨界萃取方法提取紫蘇籽油的工藝，出油率分別是39.7%和40.1%，且發(fā)現(xiàn)超臨界萃取紫蘇籽油的理化性質(zhì)較好。傳統(tǒng)提取方法一般為機械壓榨法和溶劑提取法，溶劑浸提法的出油率最高，但溶劑殘留嚴重；機械壓榨法工藝簡單，易于流水線生產(chǎn)，應(yīng)用較廣，分為熱榨法和冷榨法，熱榨過程中高溫容易使α-亞麻酸等有效成分損失。因此在本文中研究兩種冷榨法——螺旋壓榨法和液壓法對紫蘇籽油提取的影響，與傳統(tǒng)有機溶劑浸提法進行比較，并對其理化性質(zhì)以及抗氧化性等進行分析，旨在通過對比不同提取方法對紫蘇籽油提取率及品質(zhì)的影響，為紫蘇籽油及其他功能油脂的深入開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇籽：浙江科技學(xué)院重點實驗室花圃；中級初榨橄欖油：北京市品利食品有限公司；雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺 [bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA]-三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS）（體積比99∶1）為色譜純：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；UV-5500PC型紫外分光光度儀：上海元析儀器有限公司；DFT-100型藥用粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；DSH-50A-1型水分測定儀：上海佑科儀器儀表有限公司；DD85G型螺旋壓榨機：德國KOMET公司；QYZ-550型液壓榨油機：泰安市良君益友機械有限公司；Allegin X-12R臺式大容量冷凍離心機：杭州合眾生物科技有限公司；7890A-5975C型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：鄭州中譜儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫蘇籽油的提取

1.2.1.1 螺旋壓榨法

其工藝流程：紫蘇籽→70℃干燥2 h→壓榨→過濾→粗紫蘇籽油[16]。安裝壓榨機加熱套，設(shè)定溫度為90℃，預(yù)熱15 min后取下加熱套并關(guān)閉加熱開關(guān)，加入70℃烘干的紫蘇籽進行壓榨，將壓榨所得毛油經(jīng)過濾離心，得到粗紫蘇籽油，儲存于4℃冰箱中待用，并計算出油率。

1.2.1.2 液壓壓榨法

其工藝流程：紫蘇籽→70℃干燥2 h→壓榨→粗紫蘇籽油，壓榨前液壓機60℃預(yù)熱0.5 h，加入物料后進行60℃壓榨，壓力由0 MPa升至60 MPa后持續(xù)壓榨1 h[16]。收集紫蘇籽油儲存于4℃冰箱中待用，并計算出油率。

1.2.1.3 正己烷浸提法

使用正己烷作為溶劑在索氏提取器內(nèi)浸提紫蘇籽油。其操作步驟為：紫蘇籽→70℃干燥2 h→粉碎→正己烷浸提6 h→瓶底溶劑回收→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→粗紫蘇籽油。

紫蘇籽的出油率按公式1計算：

式中：m1為紫蘇籽油的質(zhì)量，g；m2為紫蘇籽的質(zhì)量，g。

1.2.2 紫蘇籽油理化特性檢測

酸值測定參考GB 5009.229-2016《食品安全國家標準食品中酸價的測定》[17]；過氧化值測定參考GB 5009.227-2016《食品安全國家標準食品中過氧化值的測定》[18]；碘值測定參考GB/T 5532-2008《動植物油脂碘值的測定》[19]；皂化值測定參考GB/T 5534-2008《動植物油脂皂化值的測定》[20]；水分及揮發(fā)物含量測定參考GB 5009.236-2016《食品安全國家標準動植物油脂水分及揮發(fā)物的測定》[21]；透明度、氣味、滋味測定參考GB/T 5525-2008《植物油脂透明度、氣味、滋味鑒定法》[22]。

1.2.3 紫蘇籽油脂肪酸組成的測定

硅烷化：稱取樣品油脂0.2 g～0.3 g于50 mL離心管中，加入2 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液6 mL混勻，25℃下超聲提取10 min，取出后于60℃烘箱中皂化1 h。取出漩渦混合2 min，冷卻至25℃。加入4 mL水和6 mL正己烷，漩渦混合提取5 min，4 500 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層有機相至玻璃試管中，加入1.5 g無水硫酸鈉，靜置至澄清透明。轉(zhuǎn)移全部上清液于15 mL具塞玻璃離心管中，25℃下氮氣吹干。加入200 μL硅烷化試劑BSTFA-TMCS（體積比為99∶1），密封后于70℃烘箱中反應(yīng)30 min，再加入1 mL正己烷溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

色譜條件：HP-5MS（30 m×0.25 μm）毛細管柱；升溫程序：柱子初始溫度100℃，保持1 min；以5℃/min升至200℃，保持2 min；再以3℃/min升至280℃，保持3 min；載氣為高純氦；進樣方式為分流進樣，分流比1 ∶50；進樣量為 1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源（EI源）；電子能量70eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；溶劑延遲2.6 min；全掃描模式（SCAN），掃描范圍 50 u～1000 u；NIST 譜庫。

1.2.4 紫蘇籽油抗氧化性的測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力

取一定體積紫蘇籽油于10 mL離心管中，加乙酸乙酯至1mL，加120μmol/LDPPH-乙酸乙酯溶液4mL?；靹蜢o置30 min后用乙酸乙酯做參照，在517 nm下測定其吸光度Ai，同時測定DPPH-乙酸乙酯溶液與1 mL乙酸乙酯混合液的吸光度A0以及一定紫蘇籽油加乙酸乙酯至5 mL的混合液吸光度B[23-24]。以橄欖油為對照，根據(jù)式（2）計算清除率：

式中：Ai為加紫蘇籽油反應(yīng)后DPPH溶液的吸光度；A0為不加紫蘇籽油，只加DPPH溶液的吸光度；B為不加DPPH溶液時，紫蘇籽油在517 nm波長下的吸光度。

1.2.4.2 羥基自由基清除能力

查閱文獻得知，測定羥基自由基清除率的方法有：電子自旋共振法、高效液相色譜層析法、化學(xué)發(fā)光法、氧化褪色光度法、自動電位滴定法和極譜法等[25-30]。本試驗采用化學(xué)發(fā)光法對紫蘇籽油的羥基自由基含量進行測定。

配置不同濃度的樣品液，取一定體積梯度的牡丹籽油溶于1mL無水乙醇中，混勻，充分溶解，10000r/min離心10 min，取上清液100 μL于10 mL試管中，加入5 mL無水乙醇，充分混勻，待測。

在10 mL試管中依次加入磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）、鄰菲羅啉乙醇溶液、去離子水、FeSO4溶液（0.75 mmol/L），加入雙氧水（0.01%）和牡丹籽油樣品液啟動Fenton反應(yīng)。按表1順序加入各溶液。

表1 加入溶液的種類和體積Table 1 The type and volume of added solution

反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴中，反應(yīng)3 h，反應(yīng)完全后立即取出并測定其在536 nm處的吸光度，以去離子水為參比。以橄欖油為對照，按式（3）計算羥基自由基的清除率：

式中：Ai為紫蘇籽油樣品液的吸光度；A0為不含樣品液和雙氧水的吸光度；B為只含雙氧水的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)表示為Mean±SD，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件和Origin 8.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理和分析，并采用Duncan’smultiple rang test進行組間顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取紫蘇籽油的出油率比較

試驗測試不同方法對紫蘇籽出油率的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同提取方法對紫蘇籽出油率的影響Table 2 Effects of different methods on perilla seed oil extraction rate

由表2可知，紫蘇籽采用正己烷浸提法的出油率為（27.93±1.50）%，高于液壓出油率的（20.70±0.42）%和螺旋壓榨出油率的（9.66±0.65）%。正己烷浸提紫蘇籽經(jīng)干燥粉碎，且提取時間久，提取比較完全，出油率最高，但其存在溶劑殘留等安全問題。按照相同條件處理的原料，原料顆粒度小，含水量7.5%左右，兩種冷榨法相比較，液壓法出油率遠高于螺旋壓榨法，更有利于紫蘇籽油的提取。

2.2 不同方法提取紫蘇籽油理化特性比較

不同提取方法對紫蘇籽油理化特性的影響見表3。

表3 不同提取方法對紫蘇籽油的理化特性的影響Table 3 Effects of different extraction methods on physicochemical properties of perilla seed oil

兩種壓榨紫蘇籽油中水分及揮發(fā)物含量較低，有利于油脂的長期保存，而在正己烷浸提紫蘇籽油中較高，極可能是溶劑殘留。3種提取方式得到的油脂中，正己烷浸提油脂的酸值最高，表明其游離脂肪酸含量較高，易被氧化。液壓提取油脂的酸值最低，僅為（0.46±0.12）mgKOH/g，符合食用植物油衛(wèi)生標準（植物原油酸值＜4.0 mgKOH/g）。過氧化值是評判油脂氧化程度的指標之一，3個油樣中浸提油脂的過氧化值最高，其次是螺旋壓榨油脂，最低的為液壓油脂，表明液壓油脂的被氧化酸敗程度較低。3種紫蘇籽油的碘值差異不顯著，均大于130 gI2/100 g，表明其不飽和脂肪酸含量很高，屬于干性油脂。正己烷浸提紫蘇籽油的皂化值較高，螺旋壓榨和液壓紫蘇籽油相對較低，表明浸提紫蘇籽油中脂肪酸分子質(zhì)量大于兩種壓榨紫蘇籽油。螺旋壓榨法所得紫蘇籽油略有混濁，是由壓榨過程中混入細微物料過濾不徹底造成。兩種壓榨紫蘇籽油均具有紫蘇籽油特有氣味，而正己烷浸提法所得紫蘇籽油香味較淡，可能是由于索式提取過程中揮發(fā)性物質(zhì)的損失所致。

2.3 不同方法提取紫蘇籽油的脂肪酸組成分析

分別將3種紫蘇籽油用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析鑒定，得到其總離子流圖譜，進一步利用NIST98標準譜庫檢索，并結(jié)合有關(guān)文獻進行人工譜圖解析，確定了3種紫蘇籽油的主要脂肪酸組成，并采用峰面積歸一化法計算得到各組分的相對含量，結(jié)果見表4。

表4 不同提取方法所得紫蘇籽油脂肪酸組成Table 4 Composition of perilla seed oil extracted by screw press method%

由表4可知，紫蘇籽油主要含5種脂肪酸，即棕櫚酸、油酸、亞麻酸、亞油酸、硬脂酸。3種提取方式制得紫蘇籽油中，液壓油脂中亞麻酸相對含量最高，占總脂肪酸的（68.84±0.07）%，螺旋壓榨和液壓油脂中亞麻酸含量無顯著性差異，分別為（57.20±0.57）%和（57.04±1.77）%。3種油脂不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量有顯著差異（p＜0.01），液壓紫蘇籽油（89.00%）＞螺旋壓榨紫蘇籽油（83.00%）＞正己烷浸提紫蘇籽油（77.00%）。

2.4 不同方法提取紫蘇籽油抗氧化性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力

不同提取方法制得的紫蘇籽油對DPPH自由基的清除能力見圖1。

圖1 紫蘇籽油對DPPH自由基清除作用的體積濃度-效應(yīng)關(guān)系Fig.1 Volume concentration effect relationship of perilla seed oil on scavenging DPPH radical

3種紫蘇籽油和橄欖油對DPPH自由基的清除率均隨著油脂體積濃度的增大先升高而后趨于平穩(wěn)。當紫蘇籽油體積濃度達到32 μL/mL時，3種紫蘇籽油對DPPH自由基的清除率均達到最大值，接近95%。IC50表示達到最大清除率一半時的底物用量，與物質(zhì)的抗氧化性能成反比，IC50值越小，說明其抗氧化性能越強。螺旋壓榨法、液壓法和正己烷浸提法所得紫蘇籽油清除DPPH自由基的IC50值分別為6.37、10.33、12.13 μL/mL，橄欖油則為13.97 μL/mL，表明紫蘇籽油的抗氧化性顯著高于橄欖油，其中，螺旋壓榨油脂的抗氧化性高于液壓和正己烷浸提油脂，說明螺旋壓榨法保留了紫蘇籽油中更多的抗氧化成分。

2.4.2 羥基自由基清除能力

羥基自由基清除率是反應(yīng)油脂抗氧化作用的重要指標之一。圖2為不同紫蘇籽油對羥基自由基的清除能力。

圖2 紫蘇籽油對羥基自由基清除作用的體積濃度-效應(yīng)關(guān)系Fig.2 Volume concentration effect relationship of the effect of perilla seed oil on hydroxyl radical scavenging

由圖2可知，3種紫蘇籽油對羥基自由基的清除能力遠大于橄欖油。隨著油脂體積濃度的增加，其對羥基自由基的清除能力急劇升高，達一定濃度后趨于穩(wěn)定。在 1.0 μL/mL～2.0 μL/mL 階段，螺旋壓榨紫蘇籽油對羥基自由基的清除率遠高于其他油脂。在體積濃度大于2.0 μL/mL后，3種紫蘇籽油的清除能力逐漸接近，并達到最大值。螺旋壓榨法、液壓法、正己烷浸提法所得紫蘇籽油和橄欖油對清除羥基自由基的IC50值分別為 0.996、2.13、1.88、5.72 μL/mL，表明螺旋壓榨油脂清除自由基的能力更強。

3 結(jié)論

本研究中3種不同提取方法對紫蘇籽油提取的影響均存在顯著差異，正己烷浸提法出油率最高，為（27.93±1.50）%，但液壓法（20.70±0.42）%和螺旋壓榨法（9.66±0.65）%更加綠色安全，無溶劑殘留等問題。液壓法的出油率遠高于螺旋壓榨法，且制得油脂的酸值和過氧化值均小于其他兩種油脂，皂化值和碘值等無顯著性差異，更有利于紫蘇籽油的提取。通過脂肪酸分析，液壓紫蘇籽油中亞麻酸相對含量高達（68.84±0.07）%，高于螺旋壓榨油脂的（57.20±0.57）%和正己烷浸提油脂的（57.04±1.77）%。在體外抗氧化活性方面，螺旋壓榨紫蘇籽油對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力均高于其他兩種油脂。