張士彥,盧秋霞,賀麗波,孫意冉,羅朝梅,李 玉,黃 磊,唐 琳

(四川大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院;b.新能源與低碳技術(shù)研究院,四川 成都 610000)

樺褐孔菌[Inonotusobliquus(Fr.)Pilat]屬于銹革孔菌科、纖孔菌屬的一種民間藥用真菌[1,2],廣泛分布在美國北部、俄羅斯西伯利亞、日本北海道和我國吉林長白山、黑龍江大興安嶺等地區(qū),從16世紀(jì)開始在民間常被用來預(yù)防和治療心血管病、腸胃癌、糖尿病等[3]。樺褐孔菌中除了含有多酚、多糖、萜類、甾體、芳香族化合物,還含有少量的氨基酸、蛋白質(zhì)、固醇類、色素等生物活性物質(zhì)[4,5],其中主要的化合物原兒茶醛、丁香酸和(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮具有很好的抗炎[6]、抑制酪氨酸酶[7]、抗菌[8,9]、抗腫瘤[10]等活性,且在其他真菌中均有存在[11-13],因此有必要建立一種快速高效的分析方法對樺褐孔菌進(jìn)行定量分析,以便對樺褐孔菌的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。

高遠(yuǎn)等[14]采用高效液相色譜(HPLC)法對樺褐孔菌中的麥角甾醇、白樺脂醇、羊毛甾醇、膽甾醇、谷甾醇和豆甾醇進(jìn)行了定量分析,但存在分離時(shí)間長、溶劑消耗大等傳統(tǒng)液相色譜共有的缺點(diǎn)[15]。超高效液相色譜(UPLC)作為一種新型的色譜技術(shù),因其簡單、快速(幾分鐘內(nèi)出峰)、節(jié)省溶劑、檢出限低、色譜柱耐高壓、填充顆粒小、分離效果好的特點(diǎn),得到了廣泛的應(yīng)用[16-18]。本文首次采用UPLC法對樺褐孔菌中的3種主要成分原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮同時(shí)進(jìn)行了定量分析,旨在為樺褐孔菌的質(zhì)量評價(jià)和資源開發(fā)利用提供參考資料。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

分別以產(chǎn)地為黑龍江大興安嶺、吉林長白山、俄羅斯西伯利亞的樺褐孔菌子實(shí)體作為實(shí)驗(yàn)材料,經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院白潔副教授鑒定為樺褐孔菌子實(shí)體。

1.2 試劑與儀器

主要試劑:甲醇、乙腈為色譜純,購置于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;其他試劑均為分析純,購置于成都科龍化工試劑廠;原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮均為本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到(純度≥98%)。

主要儀器:超高效液相色譜儀(UPLC),配備二極管陣列檢測器(PDA,美國Waters公司)，SB-300DTY型超聲波掃頻清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、MS半微量電子精密分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)、5418R型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、HK-UP-IV-20純水機(jī)(成都浩康科技有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為CORTECS UPLC T3(2.1mm×100mm,1.6μm),流動(dòng)相A為乙腈,B為0.1%甲酸水溶液,流速0.4mL/min,采用梯度洗脫方法:10%—30% A(0—1.5min),30—42% A(1.5—5min),42—90% A(5—6min),90—10% A(6—6.01min),10% A(6.01—8min);樣品室溫25℃、柱溫40℃;檢測波長280nm;進(jìn)樣量1μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮對照品適量,用色譜甲醇分別配制成1.20mg/mL的母液,等體積吸取各對照品溶液混合,即得400μg/mL的混合對照品儲(chǔ)備液,備用。

2.3 樣品溶液的制備

稱取樺褐孔菌子實(shí)體粉末1g,加入25mL的95%乙醇,在40℃、59 KHz條件下超聲提取20min,重復(fù)3次,抽濾,合并濾液,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空濃縮至干燥,加適量水重懸,按體積比1∶1依次用正己烷(5次)、二氯甲烷(10次)進(jìn)行萃取,二氯甲烷萃取液減壓濃縮至干燥,即得二氯甲烷萃取相。取適量稱重,配制成100μg/mL的樣品液,0.22μm PTFE微孔濾膜過濾,12000rpm,離心5min,取上清待用。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)條件下的混合對照品儲(chǔ)備液,將儲(chǔ)備液稀釋至6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL、0.78125μg/mL、0.390625μg/mL、0.1953125 μg/mL,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下,將各濃度混合對照品溶液進(jìn)行測定,計(jì)算峰面積。以各濃度混合對照品溶液中各成分峰面積為縱坐標(biāo)(Y),以各混合對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程及線性范圍。檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別由信噪比(S/N)為3和10時(shí)所對應(yīng)的樣品液濃度表示,結(jié)果見表1。

表1 樺褐孔菌中三種化合物線性關(guān)系相關(guān)參數(shù),LOD和LOQ

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份混合對照品溶液,按照“2.1”項(xiàng)條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算各成分峰面積的RSD,檢測其日內(nèi)精密度;進(jìn)樣3次,連續(xù)3天,計(jì)算各成分峰面積的RSD,檢測其日間精密度。

經(jīng)日內(nèi)精密度檢測,原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面積RSD分別為0.422%、0.315%、0.234%;經(jīng)日間精密度檢測,原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面積RSD分別為1.005%、0.734%、0.397%。RSD均小于2%,說明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次樺褐孔菌子實(shí)體粉末6份,按照“2.3”項(xiàng)條件制備樣品,進(jìn)樣,計(jì)算峰面積,并計(jì)算各成分峰面積的RSD,考察方法重復(fù)性。經(jīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測,原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面積RSD分別為0.176%、0.174%、0.129%,RSD均小于2%,說明此方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表2 三種化合物回收率實(shí)驗(yàn)

取同一份樣品溶液,分別在0、7h、20h、25h、46h、50 h按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣,計(jì)算峰面積,并計(jì)算各成分峰面積的RSD,考察樣品的穩(wěn)定性。經(jīng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測,原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面積RSD分別為2.137%、1.436%、0.940%,RSD均小于3%,說明樣品溶液在50h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取已知濃度的樣品溶液,按體積比1:1加入相當(dāng)于樣品濃度50%、100%、150%的混合對照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定,計(jì)算各成分峰面積,并計(jì)算各成分回收率和峰面積的RSD,結(jié)果見表2。原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮的平均回收率在95.787%—100.324%范圍內(nèi),且RSD均小于3%,表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.9 樣品的測定

取黑龍江大興安嶺、俄羅斯西伯利亞、吉林長白山樺褐孔菌子實(shí)體粉末各1g,按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品,按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行UPLC檢測,計(jì)算不同產(chǎn)地各成分含量,結(jié)果見表3。混合對照品溶液和樺褐孔菌二氯甲烷萃取相色譜見圖1。

表3 不同產(chǎn)地間三種化合物的含量測定

注:1為原兒茶醛;2為丁香酸;3為(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮。

3 結(jié)論與討論

樺褐孔菌作為一種非常有效的民間藥用真菌,常用來預(yù)防和治療多種疾病,但此真菌未被列入中國藥典,對其質(zhì)量評價(jià)及成分含量測定也缺乏一定的科學(xué)依據(jù)。本研究考察了CORTECS UPLC T3(2.1mm×100mm,1.6μm),ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)和ACCQ-TAG ULTRA C18(2.1mm×100mm,1.7μm)三種色譜柱在相同條件下的分離效果,結(jié)果表明,CORTECS UPLC T3色譜柱分離效果較好。有文獻(xiàn)表明[19],流動(dòng)相組成、流速、進(jìn)樣量等會(huì)影響物質(zhì)在液相中的分離度,因此本文對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,分別對流動(dòng)相的組成(甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水)、流動(dòng)相的比例、流速及進(jìn)樣量進(jìn)行篩選。結(jié)果表明,在流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液、流速0.4 mL/min、進(jìn)樣量1 μL的條件下各物質(zhì)達(dá)到基線分離。含量測定結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地樺褐孔菌中原兒茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羥基苯基)丁-3-烯-2-酮含量差異明顯,分析其原因可能是不同產(chǎn)地之間生長環(huán)境以及采摘時(shí)間不同所導(dǎo)致。在以后的選材中,可選擇含量最高的產(chǎn)地的樺褐孔菌作為實(shí)驗(yàn)原材料,以便后續(xù)的深入研究。

本文所定量的3種主要化合物是本實(shí)驗(yàn)室采用高速逆流色譜聯(lián)合半制備液相色譜法首次分離純化得到,均其有較好的生物活性,是樺褐孔菌發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用的活性成分[20-23],因此對其進(jìn)行定量有助于后續(xù)對樺褐孔菌活性的研究。傳統(tǒng)測定化合物含量的高效液相色譜法和紫外分光光度法分別存在分析時(shí)間長、操作繁瑣、不能同時(shí)測定多種化合物的含量等弊端。本文采用的UPLC法操作簡單、高效快速，可同時(shí)測定多種化合物的含量,且測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠[24,25]。綜上所述,本研究建立的測定3種化合物含量的方法,簡單快速、線性關(guān)系、重復(fù)性良好且準(zhǔn)確可靠,可用于樺褐孔菌的質(zhì)量控制及其開發(fā)利用。