黃玉 劉磊 劉愛(ài)國(guó)

鼓室硬化是指鼓膜固有層、中耳粘膜下層結(jié)締組織甚或乳突發(fā)生透明樣變性、鈣質(zhì)沉著或骨化改變，它的形成通常經(jīng)歷炎性滲出、透明樣變和鈣化形成三個(gè)階段。盡管關(guān)于鼓室硬化臨床和形態(tài)學(xué)方面的研究有很多，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，通常認(rèn)為其發(fā)病與細(xì)菌感染、氧自由基損傷、高鈣、一氧化氮、解剖、遺傳、免疫、分泌性中耳炎長(zhǎng)期置管、骨形態(tài)生成蛋白等因素有關(guān)[1～7]，臨床上多采用手術(shù)治療。

為了探討鼓室硬化的發(fā)病機(jī)制，很多研究構(gòu)建了鼓室硬化的動(dòng)物模型。大多數(shù)研究者通常采用細(xì)菌鼓室內(nèi)注射的方法來(lái)構(gòu)建動(dòng)物模型，而所選用的細(xì)菌通常是肺炎鏈球菌。由于抗生素的濫用，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象在全球已經(jīng)變的越來(lái)越廣泛[8,9]，在引起抗生素抵抗的這些菌種中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)比較受關(guān)注。在皮膚感染、軟組織感染、血行感染、醫(yī)院獲得性感染等眾多感染的治療過(guò)程中，MRSA都是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題。在耳相關(guān)疾病中，MRSA感染率已經(jīng)從0.3%上升到了24.8%[10～13]，因此，本研究選用鼓室內(nèi)接種MRSA來(lái)構(gòu)建大鼠鼓室硬化模型，旨在探討該方法的可行性，為鼓室硬化的研究提供一種新的動(dòng)物造模方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF(specific pathogen free)級(jí)雄性SD大鼠34只，體重200 g，經(jīng)耳科顯微鏡觀察證實(shí)外耳道和鼓膜均正常。將34只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組17只和對(duì)照組17只。實(shí)驗(yàn)組左耳進(jìn)行鼓室硬化造模，實(shí)驗(yàn)組右耳和對(duì)照組雙耳不予處理。

1.2MRSA懸液制備 由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室提供MRSA菌株。將菌株挑至羊血瓊脂平板置于CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水將菌落調(diào)制成濃度為1×108/L的懸液備用。

1.3鼓室硬化動(dòng)物造模 于實(shí)驗(yàn)組SD大鼠腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛(3.5 ml/kg)進(jìn)行全身麻醉，將左耳固定朝上，耳科顯微鏡下充分暴露外耳道和鼓膜。用1 ml注射器抽取0.04 ml濃度為1×108/L的MRSA懸液，于左耳鼓膜前上象限進(jìn)行鼓室內(nèi)注射。所有大鼠均未給予任何局部或全身抗感染治療。

1.4耳顯微鏡下觀察方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 分別于造模后第1、2、4、6周，在耳微鏡下觀察并記錄所有存活大鼠雙耳鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化的程度。鼓膜充血分為4個(gè)程度：“-”無(wú)鼓膜充血；“+”錘骨柄附近有充血；“++”除了錘骨柄附近充血外，錘骨韌帶也有充血；“+++”充血蔓延至整個(gè)鼓膜。鼓室積膿分為4個(gè)程度：“-”無(wú)鼓室積膿；“+”鼓室積膿的體積不超過(guò)鼓室腔總體積的25%；“++”鼓室積膿的體積介于25%到50%之間；“+++”鼓室積膿的體積超過(guò)鼓室腔總體積的50%[14]。鼓室硬化分為4級(jí)：0級(jí)，無(wú)鼓室鈣化灶；1級(jí)，鼓膜臍部出現(xiàn)局部鈣化灶；2級(jí)，除了鼓膜臍部出現(xiàn)鈣化灶外，錘骨柄和鼓環(huán)也出現(xiàn)鈣化灶；3級(jí)，鈣化灶遍布整個(gè)鼓膜[15,16]。

1.5石蠟切片與HE染色 取正常大鼠的左耳聽(tīng)泡及鼓室硬化大鼠的左、右耳聽(tīng)泡，分別經(jīng)過(guò)固定劑固定、乙醇脫水、二甲苯透明，經(jīng)過(guò)透明的聽(tīng)泡在恒溫箱中用石蠟和二甲苯進(jìn)行透蠟(處理3次，每次15分鐘)，然后用蠟進(jìn)行包埋，于包埋聽(tīng)泡的長(zhǎng)軸進(jìn)行多個(gè)切片，并做好標(biāo)注。將做好的石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精中進(jìn)行脫蠟，用蒸餾水沖洗后進(jìn)行蘇木素染核、鹽酸酒精分化及氨水返藍(lán)，流水沖洗后用伊紅染細(xì)胞質(zhì)，蒸餾水洗后放入梯度酒精和二甲苯中脫水透明，晾干后用中性樹(shù)膠封片，最后進(jìn)行顯微鏡觀察及圖像采集。

2 結(jié)果

造模后第1周末，實(shí)驗(yàn)組17只大鼠(分別編為1～17號(hào))34耳中有16耳(47.06%，左側(cè)15耳，右側(cè)1耳)成功誘發(fā)急性化膿性中耳炎，主要表現(xiàn)為鼓膜穿孔、鼓膜充血和鼓室積膿，無(wú)鼓室硬化形成耳(表1)；第2周末，實(shí)驗(yàn)組共有16只大鼠存活，2號(hào)大鼠因肺部感染死亡，將余下16只大鼠重新編為1～16號(hào)，32耳中有16耳(50.0%，左側(cè)13耳，右側(cè)3耳)發(fā)生化膿性中耳炎，左側(cè)中4耳發(fā)生鼓室硬化(12.5%)，每只大鼠雙耳內(nèi)鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化程度見(jiàn)表2。第4周末，實(shí)驗(yàn)組共有13只大鼠存活，1號(hào)和7號(hào)大鼠皆因肺部感染死亡，16號(hào)大鼠因麻醉過(guò)量死亡，將13只大鼠重新編為1～13號(hào)；26耳中有15耳(57.7%，左側(cè)11耳，右側(cè)4耳)發(fā)生化膿性中耳炎，有10耳(38.5%)發(fā)生鼓室硬化，左耳7耳，右耳3耳；每只大鼠雙耳內(nèi)鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化程度見(jiàn)表3。第6周末，實(shí)驗(yàn)組共有11只大鼠存活，1號(hào)和13號(hào)大鼠因肺部感染死亡，將11只大鼠重新編為1～11號(hào)；22耳中有1耳(4.5%)存在化膿性中耳炎，有12耳(54.5%)發(fā)生鼓室硬化，左耳7耳，右耳5耳；每只大鼠鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化程度見(jiàn)表4。

表1 實(shí)驗(yàn)組造模后1周耳顯微鏡觀察所見(jiàn)

表2 實(shí)驗(yàn)組造模后2周耳顯微鏡觀察所見(jiàn)

表3 實(shí)驗(yàn)組造模后4周耳顯微鏡觀察所見(jiàn)

表4 實(shí)驗(yàn)組造模后6周耳顯微鏡觀察所見(jiàn)

對(duì)照組的17只大鼠中，有2只于第4周末因麻醉過(guò)量死亡，余15只大鼠全部存活至造模后第6周，所有對(duì)照組大鼠雙耳在整個(gè)造模觀察期間均未發(fā)生任何異常改變。

兩組耳顯微鏡下及石蠟切片HE染色觀察結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

3 討論

細(xì)菌感染是急、慢性化膿性中耳炎最常見(jiàn)的病因，而Wielinga等[17]于1993年指出，中耳反復(fù)的急、慢性炎癥刺激及長(zhǎng)期的化膿性或漿液性滲出是導(dǎo)致鼓室硬化最重要的病因；另有研究[5]也通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，慢性化膿性中耳炎有20%～43%有發(fā)展成鼓室硬化的傾向。因此，本研究模擬人類鼓室硬化的這一主要病因，給予實(shí)驗(yàn)組大鼠鼓室內(nèi)注射MRSA，誘導(dǎo)其發(fā)生化膿性中耳炎，從而構(gòu)建鼓室硬化模型。從文中結(jié)果看，光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組HE染色下的中耳組織，可見(jiàn)鼓膜和鼓室粘膜增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維增生、細(xì)胞間質(zhì)增多、新血管形成等改變，這些改變與鼓室硬化的形態(tài)學(xué)改變[17,18]一致。

文中結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠造模后1周，絕大多數(shù)大鼠左耳均出現(xiàn)不同程度的鼓膜充血和鼓室積膿等急性化膿性中耳炎的表現(xiàn)，造模后2周，已有部分大鼠發(fā)生鼓室硬化；隨著病程的延長(zhǎng)，鼓膜充血消退、鼓室膿液吸收，急性中耳炎的癥狀逐漸消失，至6周末11只大鼠22耳中已有12耳發(fā)展成鼓室硬化，余下未發(fā)生鼓室硬化耳趨于愈合，說(shuō)明本研究所用方法可成功構(gòu)建大鼠鼓室硬化模型。另外，本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組大鼠鼓室硬化不僅發(fā)生于注射細(xì)菌耳，也可發(fā)生于對(duì)側(cè)未注射細(xì)菌耳，且兩側(cè)耳發(fā)展成鼓室硬化的過(guò)程同步。分析其原因，可能是金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生外毒素，外毒素由MRSA產(chǎn)生后，通過(guò)血液循環(huán)感染對(duì)側(cè)耳，使對(duì)側(cè)耳亦發(fā)生急性化膿性中耳炎，再通過(guò)炎癥刺激組織修復(fù)，炎癥消退，鈣質(zhì)沉著，發(fā)生鼓室硬化。

綜上所述，鼓室內(nèi)接種MRSA構(gòu)建鼓室硬化動(dòng)物模型的方法切實(shí)可行，且與鼓室硬化的臨床發(fā)病過(guò)程極為接近，本研究為探索鼓室硬化的發(fā)病機(jī)制提供了一種新的鼓室硬化動(dòng)物造模方法。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組耳科顯微鏡下觀察到的化膿性中耳炎和鼓室硬化不同程度的改變 a.正常鼓膜(左);b.+鼓室積膿(左);c.++鼓室積膿(左);d.++鼓室積膿(右);e.+++鼓室積膿(左);f.+++鼓室積膿(右);g.+++鼓室積膿,伴1級(jí)鼓室硬化(右);h.++鼓室積膿,伴2級(jí)鼓室硬化(左);i.3級(jí)鼓室硬化(左);j.3級(jí)鼓室硬化(右)

圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組鼓膜和鼓室粘膜的形態(tài)學(xué)改變(HE染色×200) a.正常鼓膜(左),可見(jiàn)層次清晰,結(jié)構(gòu)完整;b.正常鼓室粘膜(左),可見(jiàn)層次清晰,結(jié)構(gòu)完整;c.鈣化鼓膜(左),可見(jiàn)鼓膜增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維增生;d.鈣化鼓室粘膜(左),可見(jiàn)粘膜增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維增生,細(xì)胞間質(zhì)增多,新生血管形成(箭頭所指);e.鈣化鼓膜(右),可見(jiàn)鼓膜增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維增生;f.鈣化鼓室粘膜(右),可見(jiàn)粘膜增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維增生,細(xì)胞間質(zhì)增多