王川麗，王俊峰

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院 呼吸科，四川 瀘州 646000）

肺癌是全世界腫瘤相關(guān)死亡的主要的因素之一，其發(fā)病率及惡性程度高，目前尚缺少有效的治療手段。非小細(xì)胞肺癌占肺癌發(fā)病率的80%～85%，發(fā)病患者多為老年人，50%以上診斷為非小細(xì)胞肺癌的患者為70歲以上老年人，但近年來，有報道稱其發(fā)病趨于年輕化[1-3]。盡管目前科學(xué)家在肺癌的診斷及治療方面的研究取得顯著的成就，但肺癌患者的預(yù)后仍不樂觀。尤其是大部分非小細(xì)胞肺癌發(fā)病年齡大，身體狀況差，往往在就診時已處于晚期，腫瘤的死亡率、復(fù)發(fā)率極高[4-5]。因此，目前急需尋找非小細(xì)胞肺癌有效的早期診斷手段及治療靶點(diǎn)，以改善患者的生存及預(yù)后。

泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin carboxylterminal hydrolase 37,UCH37）是去泛素化酶家族成員。既往研究顯示，UCH37可以通過促進(jìn)細(xì)胞中的一些原癌基因的表達(dá)及腫瘤干細(xì)胞樣特征在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[6-8]。比如在食管癌中，UCH37異常表達(dá)，并可以作為食管癌患者預(yù)后及復(fù)發(fā)的評判指標(biāo)，其表達(dá)越高，患者手術(shù)后復(fù)發(fā)率越高，死亡率也越高[9]。然而，UCH37在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和臨床意義目前尚不清楚，需要進(jìn)一步研究探索。

本研究通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）檢測非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中UCH37的表達(dá)情況，分析UCH37的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的臨床病理特征、患者生存預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2006年1月—2012年1月西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院呼吸科63例經(jīng)手術(shù)切除并病理診斷為非小細(xì)胞肺癌的患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，并完善其隨訪資料。術(shù)中將患者的癌及癌旁組織保存于液氮中備用。本研究已經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且入選本研究的患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取 步驟參照 RNA 提取試劑盒（購自Tiangen公司）中組織總RNA提取所述步驟：組織中加入適量裂解液，研磨充分后，向組織中加入勻漿液（含有590 μl去離子水、10 μl蛋白酶K），置于56℃孵箱中孵育 25 min，離心（12 000 r/min）8 min，取上清液，棄沉淀。加入無水乙醇（上清0.5倍體積），充分混勻后將其加入吸附柱，離心（12 000 r/min）30 s，棄上清液。向柱內(nèi)加入 RW1 液 350 μl，離心（12 000 r/min）30 s，棄廢液。向柱中加入 Dnase Ⅰ液（80 μl），室溫下靜置20 min。向柱中加入 RW1液（350 μl），離心（12 000 r/min）30 s，棄廢液。向柱中加入 RW 液（500 μl），離心（12 000 r/min）30 s，棄廢液。繼續(xù)離心（12 000 r/min）2 min，棄廢液。向柱加入去離子水（50 μl），室溫下靜置 3 min，離心（12 000 r/min）2.5 min，最終溶液為實(shí)驗(yàn)用總RNA。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（購自Tiangen公司），逆轉(zhuǎn)錄步驟如下：逆轉(zhuǎn)錄體系混合液 ：含 1 μl 10× RT Mix，1μl Oligo-（dT）15，1 μl dNTPs，1 μl RNA，1 μl Quant逆轉(zhuǎn)錄酶，5 μl去離子水。混勻后37℃孵箱中靜置1 h。

1.2.3 qRT-PCR qRT-PCR 步驟參照 SYBR Green Ⅰ試劑盒（購自Tiangen公司），說明書操作。試劑A：20×SYBR 溶液 125 μl，2.5×Real Master Mix 1.0 ml充分混勻。20 μl反應(yīng)體系：上述試劑A（9 μl）、正反向引物（各1 μl）、cDNA模板（2 μl）、去離子水（7 μl）混合均勻，鋪板置于PCR儀器中，設(shè)定反應(yīng)條件為 ：95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 20 s，60℃退火 20 s，68℃延伸 20 s。共設(shè)置 30 個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后分析各分子相對表達(dá)水平。UCH37正向引物：5'-TGTCTCATGGAAAGCGACCC-3'，反向引物：5'-GC CACTTGAAAAGAAAAATTAACCC-3'；內(nèi)參β-actin正向引物：5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3' ，反向引物：5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較做Log-rankχ2檢驗(yàn)；影響因素的分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCH37在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

非小細(xì)胞癌組織中UCH37相對表達(dá)水平為（2.736±0.189），癌旁組織中UCH37的相對表達(dá)水平為（0.889±0.091），非小細(xì)胞肺癌中的UCH37表達(dá)高于癌旁組織（t=8.841，P=0.007）。見圖1。

2.2 UCH37與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中UCH37 mRNA的表達(dá)水平

根據(jù)以上結(jié)果中UCH37在非小細(xì)胞肺癌中的相對表達(dá)水平，利用X-tile軟件確定最佳分界點(diǎn)3.014。將非小細(xì)胞肺癌患者分為兩組：高于此值的為UCH37高表達(dá)組，低于此值的為UCH37低表達(dá)組。結(jié)果顯示，UCH37表達(dá)與腫瘤分期（P=0.034）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.017）相關(guān)，UCH37低表達(dá)組患者腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均優(yōu)于UCH37高表達(dá)組；而與年齡、性別等特征無相關(guān)性。見表1。

2.3 UCH37與非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后生存的關(guān)系

根據(jù)UCH37表達(dá)將非小細(xì)胞肺癌患者分為兩組：UCH37高表達(dá)組、UCH37低表達(dá)組。UCH37低表達(dá)組的生存率（χ2=7.327，P=0.009）及無進(jìn)展生存率（χ2=3.153，P=0.032）均高于UCH37高表達(dá)組。見圖2。

2.4 UCH37與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

利用Cox風(fēng)險比例模型評估UCH37表達(dá)及其他臨床病理特征對非小細(xì)胞肺癌患者生存的影響。單因素分析示，臨床分期（風(fēng)險比Hazard ratio,）=5.019，P=0.009）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（，P=0.021）及 UCH37的表達(dá)（）與總體生存期相關(guān)（見表2）。選擇單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進(jìn)入多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析（采用變量篩選，逐步回歸法），引入水準(zhǔn)α=0.05，剔除水準(zhǔn)α=0.10，結(jié)果示：TNM分期（）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（）及UCH37表達(dá)（）可以作為非小細(xì)胞肺癌患者判斷預(yù)后的指標(biāo)。見表3。

表1 UCH37與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 UCH37與非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后生存期的關(guān)系

表2 影響非小細(xì)胞肺癌患者生存的單因素及參數(shù)估計

表3 影響非小細(xì)胞肺癌患者生存的多因素及參數(shù)估計

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)增高。并且UCH37與非小細(xì)胞肺癌患者TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，UCH37的表達(dá)越高，非小細(xì)胞肺癌患者的總體生存率、無進(jìn)展生存率及預(yù)后越差。以上結(jié)果提示，在非小細(xì)胞肺癌中UCH37發(fā)揮著癌基因的作用，其異常表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及進(jìn)展均有促進(jìn)作用。

泛素是一種高度保守的小分子蛋白，可以通過泛素-蛋白酶體降解途徑選擇性的降解蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能，而這一途徑是真核生物內(nèi)重要的非溶酶體途徑。研究顯示，蛋白的泛素化調(diào)節(jié)是一種可逆的生物過程。細(xì)胞中還有多種去泛素化酶，這些酶可水解底物蛋白上的泛素末端多肽鏈接，從而反向調(diào)節(jié)蛋白降解。蛋白的泛素化及去泛素化調(diào)節(jié)機(jī)制在細(xì)胞的多種生理過程包括基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞的增殖分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均有重要作用。細(xì)胞中存在5種去泛素化酶，其中以泛素羧基末端水解酶家族及泛素特異性加工酶家族為主。

UCH37是泛素羧基末端水解酶家族成員之一，可以通過拆分蛋白遠(yuǎn)端的多聚亞基來抑制蛋白質(zhì)降解。已經(jīng)證明UCH37可被Rpn13活化并摻入到19S復(fù)合物中，并可協(xié)助小鼠的心理發(fā)育，在腫瘤發(fā)生、侵襲和遷移中起重要作用[10]。UCH37可與Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2競爭結(jié)合Smad7，阻止兩者形成復(fù)合物，抑制I型TGF-β泛素化，使后者蛋白表達(dá)上調(diào)[11]。此外，有研究報道UCH37的表達(dá)下調(diào)后，Caspase-9及Caspase-3進(jìn)而活化，從而導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡增加。WANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在卵巢癌中異常高表達(dá)，其高表達(dá)預(yù)示著患者預(yù)后不良及腫瘤復(fù)發(fā)，與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，UCH37可成為協(xié)助臨床醫(yī)生判斷卵巢癌切除手術(shù)的指標(biāo)。CHEN等研究顯示UCH37在食管癌癌組織中的表達(dá)高于非腫瘤組織蛋白水平，在復(fù)發(fā)患者腫瘤組織中表達(dá)更高。UCH37表達(dá)與腫瘤的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，UCH37是患者總生存和無病生存的重要預(yù)測因子，并可作為腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)后指標(biāo)。另有研究發(fā)現(xiàn)[9]，UCH37不參與Tcf7蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，但是在非洲爪蟾胚胎和人肝癌細(xì)胞中Tcf7與靶基因啟動子的結(jié)合中UCH37是必需的，UCH37是非洲爪蟾中Wnt/β-catenin途徑中穩(wěn)定β-catenin的正調(diào)節(jié)因子。本研究為Tcf7的染色質(zhì)占有提供新機(jī)制，揭示UCH37在早期脊椎動物發(fā)育過程中的生理學(xué)意義[13]。本研究顯示，UCH37在腫瘤及生物進(jìn)化過程中發(fā)揮的重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在非小細(xì)胞肺癌中具有促癌作用。UCH37可以作為非小細(xì)胞肺癌判斷預(yù)后的分子指標(biāo)。