王佳慧 鄭洋 王嘉孺 李衛(wèi)民

[摘要] 目的 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)得到通路和基因的相關(guān)信息，分析出重要基因的功能和分布，篩選出與慢性萎縮性胃炎（CAG）相關(guān)的靶點(diǎn)基因，促進(jìn)對(duì)CAG發(fā)病機(jī)制的研究以及新藥的開發(fā)。 方法 2018年6月以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索CAG的相關(guān)基因，將得到的基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，得到基因富集的通路數(shù)據(jù)。15個(gè)非冗余基因富集在20條KEGG通路上進(jìn)行了分析，將15個(gè)基因輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)做相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，將富集在通路上的關(guān)鍵基因也做網(wǎng)絡(luò)圖，并且將這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行比較。 結(jié)果 在兩張網(wǎng)絡(luò)圖中，F(xiàn)ASLG、FAS、ICAM1、IL1B、AKT1、STAT3、TGFβ1、IL4R、IL11、IL23A是位于關(guān)系度排名靠前的基因。 結(jié)論 STAT3、ICAM1、IL1B、TGFβ1和AKT1五個(gè)基因與CAG相關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究，通過分析與疾病相關(guān)基因的所在通路和基因之間互作的網(wǎng)絡(luò)圖，有利于了解疾病的發(fā)病機(jī)制，并為新藥研發(fā)提供可靠的靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 慢性萎縮性胃炎;基因互作網(wǎng)絡(luò);KEGG通路;富集分析

[中圖分類號(hào)] R573.32? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）01（b）-0159-06

[Abstract] Objective By means of DAVID database， the information related to pathway and gene was obtained， the function and distribution of important gene was analyzed， the target gene related to chronic atrophic gastritis （CAG） was screened， so as to promote the research on CAG pathogenesis and the development of new drug. Methods By taking “chronic atrophic gastritis” as key words， the gene related to CAG was retrieved in NCBI database in June 2018 and the obtained gene data was imported into DAVID database， then the pathway of gene enrichment was figured out. Next， 15 pieces of non-redundant gene enrichment were analyzed on 20 KEGG pathways. Besides， 15 genes were input into String database to draw interaction network diagram， another network diagram for the key genes of enrichment on pathway was also made， the two network diagrams were compared. Results In the two network diagrams， the top-ranked genes in terms of relational hierarchy turned out to be FASLG， FAS， ICAM1， IL1B， AKT1， STAT3， TGFβ1， IL4R， IL11 and IL23A， etc. Conclusion The five genes of STAT3， ICAM1， IL1B， TGFβ1 and AKT1 have something to do with CAG and an in-depth research should be conducted. Moreover， the diagram which shows the interaction between the pathway and the genes related to CAG should be analyzed， which can do good to the understanding on the pathogenesis of CAG and can provide reliable target for the development of new drug.

[Key words] Chronic atrophic gastritis; Gene interaction network; KEGG pathway; Enrichment analysis

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是發(fā)生在中老年人群中的常見消化系統(tǒng)疾病，是胃癌早期病變的必經(jīng)過程[1]。中國(guó)CAG患者發(fā)病率居亞洲首位。該病發(fā)病緩慢，治療周期長(zhǎng)，西醫(yī)治療不能根除病因易反復(fù)，嚴(yán)重影響我國(guó)居民的生活質(zhì)量，如何防治CAG是目前社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題[2-3]。CAG和胃癌密切相關(guān)，臨床上把CAG稱為胃癌前病變，是我國(guó)慢性消化道疾病需要突破的重要難點(diǎn)[4-5]。CAG的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前尚無特效治療藥物。本研究結(jié)合KEGG通路和基因互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體分析，尋找CAG的藥物靶點(diǎn)。

1 研究方法

1.1 檢索CAG相關(guān)基因

以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為Homo sapiens，得到36個(gè)與CAG相關(guān)的基因。

1.2 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CAG通路進(jìn)行分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)可以分析基因功能、基因組信息，將基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。DAVID是一個(gè)在線的基因和通路功能注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)[6]。本研究用的DAVID v6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）。該數(shù)據(jù)庫(kù)可以查找基因富集通路的數(shù)據(jù)，如果要研究與疾病發(fā)生關(guān)系密切的通路，可以根據(jù)P值（P < 0.01）篩選出重要的通路進(jìn)行重點(diǎn)分析，這樣有利于對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的了解，也可以為新藥的研究提供可靠的靶點(diǎn)。

1.3 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)的操作

將得到的36個(gè)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，具體步驟如下：①進(jìn)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)的首頁(yè)，點(diǎn)擊Start Analysis;②在Paste a list里面輸入要分析的36個(gè)基因;③選擇基因ID的類型為“ENTREZ_GENE_ID”;④選擇“Gene List”;⑤提交“submit list”;⑥在list中選擇物種為“Homo sapiens”;⑦在Background中選擇“Homo sapiens”為基因背景。

1.4 顯著富集在通路上的基因互做網(wǎng)絡(luò)分析與文本挖掘

根據(jù)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析的結(jié)果，將富集在通路上的基因以及在通路上出現(xiàn)頻次達(dá)到5次以上的基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，做出這些基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)圖中的度反映了節(jié)點(diǎn)的重要性，度大的節(jié)點(diǎn)是與疾病有密切聯(lián)系的重要節(jié)點(diǎn)基因。將富集在通路上的總基因網(wǎng)絡(luò)和出現(xiàn)頻次達(dá)到5次以上的基因網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行對(duì)比匹配，找出共有的基因交集，而這些共有的基因交集可能就是疾病發(fā)生和藥物治療重要的靶點(diǎn)基因。用COREMINE[7-8]進(jìn)行文本的挖掘。

2 結(jié)果及分析

2.1 DAVID通路分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，將36個(gè)相關(guān)基因輸入，對(duì)其KEGG的路徑進(jìn)行分析，154個(gè)基因富集在37條通路上，根據(jù)P < 0.01篩選出20條通路，見表1。共有15個(gè)非冗余基因被注釋到這些通路上。在20條通路上出現(xiàn)5次及以上的共有7個(gè)基因，即AKT1、FAS、FASLG、IL1B、TGFβ1、STAT3、ICAM1。富集在20條通路頻次在10次以上的基因有AKT1、FAS、FASLG、IL1B、TGFβ1。

2.1.1 細(xì)胞因子-受體相互作用通路（cytokine-cytokine receptor interaction）? 細(xì)胞因子-受體相互作用通路包含了15個(gè)基因中的7個(gè)，包括FAS、FASLG、IL1B、IL11、IL23A、IL4R、TGFβ1。TGF-β是參與胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要刺激因子，其功能表現(xiàn)為抑制免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞，并在CAG、腸化生、胃癌中表達(dá)上調(diào)[9]。TGF-β與Ⅱ型受體結(jié)合，同時(shí)磷酸化Ⅰ型受體，激活R-SMAD，并與coSMAD、Smad4結(jié)合。同時(shí)有研究表明Smad4的表達(dá)異常與胃癌病理學(xué)特征相關(guān)，可作為臨床診斷胃癌的生物學(xué)標(biāo)志物[10]。

2.1.2 TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）? CAG為胃癌最主要的癌前病變，其演變規(guī)律為正常胃黏膜-炎癥-萎縮-腸上皮化生-不典型增生-胃癌[11]，由此可大膽推測(cè)，在CAG向胃癌演變發(fā)展過程中之中的炎癥刺激因子和癌癥啟動(dòng)因子有可能是相互重合甚至是相同的。TNF家族是炎癥發(fā)生和腫瘤啟動(dòng)的重要因子，同時(shí)也是CAG治療藥物的重要靶點(diǎn)群，其在CAG Hp感染、胃癌、消化道潰瘍等疾病過程中持續(xù)高表達(dá)[12]。TNF-α與受體相結(jié)合后，激活下游NF-κB、JNK和Caspase蛋白酶等，促進(jìn)了一系列的炎性細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、IFN-γ等的分泌[13-14]，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，同時(shí)IL-1和IL-6在傳遞信息激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化增殖與分化及在炎性反應(yīng)中起重要作用[15]。

2.1.3 Jak-STAT信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）? Jak-STAT信號(hào)通路在消化系統(tǒng)炎癥及腫瘤中的作用是目前的研究熱點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞因子與相應(yīng)的受體結(jié)合后，JAK磷酸化而活化，同時(shí)催化酪氨酸殘基磷酸化，從而使得與受體偶聯(lián)的STAT分子釋放進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因的特異序列結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[16]。研究指出STAT3在人低分化胃癌細(xì)胞株的表達(dá)明顯高于人中分化胃癌細(xì)胞株和人高分化胃癌細(xì)胞株，由此得出STAT3的過度表達(dá)可能在胃癌的惡性演變中發(fā)揮重要作用[17]。藺煥萍等[18]實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥參佛胃康逆轉(zhuǎn)CAG癌前病變的機(jī)制可能與下調(diào)STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)有關(guān)。韋維等[19]指出安胃湯可能通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子JAK1、STAT3、c-myc、SOCS-3的表達(dá)，緩解炎癥并防治CAG。

2.2 富集的基因以及出現(xiàn)的高頻次基因做網(wǎng)絡(luò)分析

有15個(gè)基因非冗余基因富集在20條通路上，有7個(gè)基因在20條通路上出現(xiàn)的頻次達(dá)到5次及以上。這7個(gè)基因可能與CAG的發(fā)病有十分密切的聯(lián)系，因?yàn)樗鼈儏⑴c了多條通路的信號(hào)傳導(dǎo)。為了研究基因之間的相互作用，將15個(gè)基因與高頻次的7個(gè)基因輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)做出相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，并將2個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行對(duì)比，在圖中節(jié)點(diǎn)的度直接反映了與疾病的關(guān)聯(lián)程度，富集在20條通路上的15個(gè)基因，在20條通路上出現(xiàn)頻次達(dá)到5次及以上的7個(gè)基因，在2個(gè)圖中節(jié)點(diǎn)的度排名均靠前的基因可能會(huì)是我們尋找的靶點(diǎn)基因。有15個(gè)節(jié)點(diǎn)、96個(gè)相互作用的關(guān)系。有7個(gè)節(jié)點(diǎn)、42個(gè)相互作用的關(guān)系。用COREMINE進(jìn)行文本的挖掘，更進(jìn)一步說明15個(gè)富集基因與CAG疾病之間的相互關(guān)系。以CAG、各個(gè)基因名稱為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)除了IL23A之外，其他14個(gè)基因均與CAG疾病發(fā)生直接的聯(lián)系，這些基因也存在相互作用，例如FAS和FASLG之間相互作用顯著。

2.3 對(duì)度排名靠前的基因功能進(jìn)行富集分析

將排名靠前的基因，輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO功能富集分析，這個(gè)過程包括分子功能、細(xì)胞組分、生物過程三個(gè)部分[20]。排名靠前的基因分子功能主要集中在與蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性。生物過程包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)作用、信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥應(yīng)答等。細(xì)胞組分主要集中在細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)。

3 討論

CAG是臨床常見的一種消化系統(tǒng)疑難疾病，目前已經(jīng)被公認(rèn)為胃癌前狀態(tài)。目前臨床尚無特效藥可以治愈該病，中醫(yī)藥治療CAG能有效緩解患者癥狀，提高其生活質(zhì)量。CAG病因病機(jī)復(fù)雜，尚待開發(fā)有效的藥物靶點(diǎn)及其相應(yīng)的治療藥物。只有發(fā)現(xiàn)合適的藥物靶點(diǎn)并對(duì)相關(guān)藥靶基因參與的通路進(jìn)行抑制才有可能治愈該疾病。

本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收集與CAG相關(guān)的基因，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)36個(gè)CAG相關(guān)的KEGG通路進(jìn)行分析，結(jié)果得到154個(gè)基因富集在37條通路上，根據(jù)P值篩選出20條通路進(jìn)，共有15個(gè)非冗余基因富集在20條通路上。出現(xiàn)頻率達(dá)到5次以上的共有7個(gè)基因，出現(xiàn)頻率達(dá)到10次以上的有5個(gè)基因。將15個(gè)非冗余基因和7個(gè)高頻詞基因分別制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。其中含有15個(gè)CAG相關(guān)基因的子網(wǎng)絡(luò)具有15個(gè)節(jié)點(diǎn)、94對(duì)互做關(guān)系;含有7個(gè)CAG相關(guān)基因的子網(wǎng)絡(luò)具有7個(gè)節(jié)點(diǎn)、42對(duì)互做關(guān)系。富集在信號(hào)通路上的非冗余基因和高頻出現(xiàn)的基因，因此在2個(gè)網(wǎng)絡(luò)中都具有較高節(jié)點(diǎn)度的基因可能與CAG具有更緊密的關(guān)系。總結(jié)2張網(wǎng)絡(luò)圖度排名靠前的基因相同的有5個(gè)。綜上所述，基因STAT3、ICAM1、IL1B、TGFβ1、AKT1可能是CAG的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-07-20? 本文編輯：張瑜杰）