游元丁，趙 陽，徐孟懷，冉茂乾，李 志，焦彥朝

(1.六盤水市山地特色生態(tài)產(chǎn)品研究中心，貴州六盤水 553000；2.國家果蔬檢測重點實驗室(六盤水)，貴州六盤水 553000；3.貴陽海關出入境檢驗檢疫綜合技術中心，貴州貴陽 550081)

實驗室一般通過內部質量控制、能力驗證或使用實驗室間比對等方式來評估檢測人員的能力，對檢測人員的資格進行確認。能力驗證活動是利用實驗室間的比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力[1-2]。中國合格評定國家認可委員會(CNAS)2018年發(fā)布實施的CNAS-RL02：《能力驗證規(guī)則》[2]中明確規(guī)定了實驗室參加能力驗證的最低要求，其中食品領域中微生物的最低參加頻次為1次/年，可見能力驗證活動已成為我國實驗室認可機構采用的主要技術手段之一。微生物實驗室質量控制的關鍵環(huán)節(jié)也是能力驗證活動，能力驗證結果直接影響到檢驗報告的準確性和質量[3]。而沙門氏菌作為常見致病菌，是很多食品安全的必檢項目，也是實驗室微生物檢測的常規(guī)致病菌，其與人的生活環(huán)境以及人體飲食健康息息相關[4]，因此沙門氏菌的檢測能力和技術水平至關重要，實驗室通過參加沙門氏菌能力驗證，驗證實驗室是否具備檢測沙門氏菌的技術能力，確保檢測活動的有效性[5]。

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原菌，屬腸桿菌科、革蘭氏陰性桿菌，其能引起人類的傷寒、副傷寒、敗血癥及場外灶性感染等多種癥候群，嚴重危害人類健康[6-7]。國家果蔬檢測重點實驗室(六盤水)2018年參加由中國認證認可監(jiān)督管理委員會(CNCA)組織的、中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心負責實施的A類項目“奶粉中沙門氏菌、克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的檢測(CNCA-18-A07)”中沙門氏菌的檢測，實驗室編號為CNCA-18-A07-214。根據(jù)國標法[8]對2個奶粉樣品進行檢測，檢測過程中用VIDAS進行初篩，生化試劑盒和全自動微生物鑒定儀(VITEK 2 COMPACT)進行生化鑒定。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源。2份奶粉樣品由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供，編號分別為18-Q018和18-W430。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑。緩沖蛋白胨水預增菌液(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、亞硫酸鉍(BS)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、營養(yǎng)瓊脂(NA)、HE分離培養(yǎng)基、沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒等均購自北京陸橋技術股份有限公司；SLM沙門氏菌檢測試劑盒(VIDAS)、VITEK 2革蘭氏陰性細菌鑒定卡購自生物梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清套裝購自天津生物芯片技術有限公司。所有培養(yǎng)基和試劑均驗證合格且在有效期內。

1.2試驗方法

1.2.1樣品處理。收到的樣品為西林瓶包裝，需用100 mL稀釋液再水化，具體操作如下：先用4 mL稀釋液進行再水化，待凍干粉充分溶解后，用無菌吸管轉移至無菌瓶中，再反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，并將清洗液全部回收至上述無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，等同于100 mL的待測乳品樣品。

1.2.2沙門氏菌預增菌和增菌。在生物安全柜中轉移25 mL待測樣品至225 mL滅菌的緩沖蛋白胨水(BPW)中，(36±1)℃于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～18 h；分別吸取1 mL預增菌液轉接到10 mL的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)中和四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)中，SC混合增菌液于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h，TTB混合增菌液于(42±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3VIDAS全自動酶聯(lián)免疫分析儀進行沙門氏菌快速篩選。從SC增菌液和TTB增菌液管中分別移取1 mL增菌液到無菌試管中，將試管于沸水中加熱15 min滅活。分別取500 mL增菌液于恢復室溫的酶聯(lián)免疫試劑條測試孔中，經(jīng)VIDAS 30酶聯(lián)免疫分析儀檢測，45 min后查看報告結果。

1.2.4選擇性分離。用3 mm的接種環(huán)從“1.2.3”中的SC和TTB增菌液中取菌液1環(huán)，劃線接種于BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板；BS瓊脂平板于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)40～48 h，XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，隨時觀察平板菌落生長情況，記錄菌落形態(tài)。

1.2.5生化鑒定試驗。選取“1.2.4”中的典型菌落明顯、分離效果好的2種類型的平板，從平板上挑取菌落轉移至營養(yǎng)瓊脂平板(36±1)℃培養(yǎng)24 h。為確保生化鑒定結果，同時采用沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒和全自動微生物鑒定儀鑒定。生化鑒定試劑盒使用根據(jù)試劑盒說明書，挑取新鮮培養(yǎng)的單個純菌落接種于三塘鐵生化管，同時挑取菌落至適量0.85%生理鹽水中，制成0.5個麥氏濁度的均勻菌懸液，按說明書添加至每個生化反應孔內，蓋上盒蓋，與三塘鐵生化管一起于(36±1)℃培養(yǎng)，氰化鉀試驗若培養(yǎng)24 h時仍為陰性，延長至48 h后觀察結果。全自動微生物鑒定儀(VITEK 2 COMPACT)用0.45%的鹽水挑取菌落制成0.50～0.63個麥氏濁度的均勻菌懸液，按儀器作業(yè)指導書進行上機鑒定。

1.2.6血清學鑒定。將“1.2.5”中符合沙門氏菌生化反應特征的樣品進行血清學鑒定。

多價菌體抗原(O)鑒定：在潔凈玻片上的2個分離區(qū)域滴加2滴生理鹽水，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，分別與玻片上的生理鹽水混勻，滴加1～2滴多價菌體(O)抗血清于玻片上一個菌落與生理鹽水的混合液中，另一個菌落與生理鹽水的混合液中加入1滴生理鹽水作為對照，用接種環(huán)分別混勻玻片上的2種混合液，輕輕搖動玻片1 min，觀察結果。

多價鞭毛抗原(H)鑒定：按多價菌體抗原(O)鑒定方法進行操作，滴加多價鞭毛抗原(H)抗血清，觀察結果。

2 結果與分析

2.1VIDAS初篩結果分別將2份奶粉樣品的增菌液滅活后用VIDAS酶聯(lián)免疫分析儀進行初篩分析，初篩結果顯示，樣品18-Q018為沙門氏菌陰性，樣品18-W430為沙門氏菌陽性。

2.2選擇性平板分離將增菌液劃線于多個平板進行選擇性分離培養(yǎng)，2份奶粉樣品18-Q018和18-W430在各平板上的菌落形態(tài)見表1。

表1 選擇性平板上菌落形態(tài)

2.3生化鑒定結果樣品18-Q018在各平板上均沒有典型菌落生長，菌落形態(tài)判斷與VIDAS的初篩結果一致，挑取2個BS平板上黑色帶金屬光澤菌落，(編號分別為18-Q018-1和18-Q018-2)、1個XLD平板上的黃色菌落(編號18-Q018-3)進行生化鑒定；樣品18-W430在各平板上都有典型菌落生長，與VIDAS初篩結果一致，挑取2個沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板的紫紅色菌落，編號分別為18-W430-1和18-W430-2，1個BS平板的灰綠色菌落，編號為18-W430-3進行生化鑒定。生化鑒定結果見表2。18-Q018-1和18-Q018-2這2個菌落分別用生化試劑盒和全自動微生物鑒定儀進行生化鑒定，生化試驗確認為非沙門氏菌，全自動微生物鑒定儀鑒定為大腸桿菌(Escherichiacoli)；18-Q018-3生化鑒定為非沙門氏菌，生化鑒定結果與VIDAS初篩結果一致，則樣品18-Q018 25 mL未檢出沙門氏菌。18-W430挑取的3個典型菌落生化鑒定結果皆為沙門氏菌陽性，則25 mL 18-W430樣品中檢出沙門氏菌。

2.4血清學鑒定結果根據(jù)生化鑒定結果，樣品18-W430的3個菌落生化鑒定結果皆為陽性，進一步進行血清學確認。挑取18-W430的瓊脂純培養(yǎng)物進行血清學鑒定，鑒定結果見表3。由生化鑒定結果和血清學鑒定結果確定25 mL樣品中，樣品18-Q018未檢出沙門氏菌，18-W430檢出沙門氏菌。

表2 樣品生化鑒定結果

注：“K”為產(chǎn)堿；“A”為產(chǎn)酸；“+”為陽性；“-”為陰性；”UD”代表未鑒定

Note： “K” is alkali production；“A” is acid production；“+” is positive；“-” is negative；“UD” stands for unidentified

表3 18-W430樣品血清學鑒定結果

注：“+”為陽性；“-”為陰性

Note：“+” is positive；“-” is negative

3 結論與討論

采用傳統(tǒng)國標方法檢測沙門氏菌，沙門氏菌的選擇性分離培養(yǎng)尤其重要，其在各種類型的平板上生長情況不一致，BS平板上生長較慢，培養(yǎng)時間較長。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基沙門氏菌菌落特征明顯，容易識別。盡管國標法中只需要2種不同培養(yǎng)基即可，但是在進行選擇性分離時，應選擇多種培養(yǎng)基進行分離，有機結合，相輔相證。

樣品18-Q018進行VIDAS初篩的結果為陰性，挑取的菌落中分離出大腸桿菌(Escherichiacoli)。樣品18-W430除了分離出沙門氏菌以外，選擇性平板上還有其他菌落形態(tài)，樣品中應添加了其他干擾菌。在實驗室有時間和條件的情況下，應繼續(xù)分離，通過繼續(xù)研究，既可以了解樣品污染情況，同時又能提高檢測人員的技術能力[9]。

傳統(tǒng)國標方法符合食品安全法的強制標準，方法成熟，對菌體濃度要求不高，但是耗時較長。酶聯(lián)免疫法VIDAS初篩時間較短，但陽性樣本還需傳統(tǒng)方法確認，在傳統(tǒng)國標方法進行的同時采用VIDAS進行初篩，可以提前摸清樣本情況，做到心中有數(shù)。目前沙門氏菌的檢測方法較多[10]，不乏很多快速檢測方法，可以采用多種方法進行確認，確保檢測結果正確。

實驗室通過參加沙門氏菌檢測能力驗證活動，可以確保實驗室沙門氏菌的檢測水平和檢測質量。參加完能力驗證之后，實驗室通過開展能力驗證分析，提高檢測人員檢測能力和技術水平，確保檢測活動的數(shù)據(jù)達到檢測質量的標準。