張小舟，帥領，王慶大，楊楠

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是位居世界第五，我國第三位的惡性腫瘤，嚴重威脅著人們的生命健康。全世界每年大約有50～100萬人因肝癌而死亡，而其死亡率還在逐年上升，總體預后較差[1]。為提高患者生存率，避免錯失最佳治療時機，早期診斷尤為重要?，F(xiàn)階段，對HCC的篩查及監(jiān)測主要依賴于實驗室檢查指標，例如血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γglutamyl transpeptidase，GGT），以及影像學方法，例如腹部B超、MRI、CT等[2]，但影像學檢查不易早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，且在肝硬化患者，小病灶往往難于與肝硬化結(jié)節(jié)相鑒別。近期有研究表明[3]，miRNAs在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，可能直接參與了癌變過程中的細胞增殖、分化、凋亡、侵襲等。有關學者[4]研究了HCC患者血清miR-16、miR-15b、miR-130b、miR-195、miR-199a 等水平變化及其臨床意義，但關于miR-335與肝癌關系的研究還較少。本研究主要探討了HCC患者血清miR-335水平的變化，并分析了應用 miR-335早期診斷HCC的可能性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年5月～2016年5月我科收治的HCC患者60例，男42例，女18例；年齡38～70歲，平均年齡（56.3±18.5）歲。符合中華人民共和國原衛(wèi)生部發(fā)布的原發(fā)性肝癌診療規(guī)范的診斷標準。根據(jù)2010年國際抗癌協(xié)會（International Union Against Cancer，UICC）關于 HCC TNM 分期標準，Ⅰ/Ⅱ期41例，Ⅲ/Ⅳ期19例。排除標準：①入院時肝功能存在嚴重障礙；②合并其他系統(tǒng)腫瘤或腫瘤遠處轉(zhuǎn)移者。慢性乙型肝炎患50例，男33例，女17例；年齡 33～60歲，平均年齡（40.1±16.1）歲；乙型肝炎肝硬化患者50例，男36例，女14例；年齡38～64歲，平均年齡（50.1±14.2）歲。另選擇同時期健康體檢者50例，男35例，女15例；年齡36～69歲，平均年齡（55.1±12.3）歲。

1.2 血清miR-335檢測 清晨，采集外周靜脈血4 ml，置于真空試管，室溫下靜置1～2 h，4000 r/m離心10 min，使用移液器小心吸取上清液，移入1.5 ml無菌無RNA酶的EP管中，貯存于-80℃冰箱保存，備用。取出血清，置于37℃水浴鍋中加熱溶解，吸取血清200μl，根據(jù)血清RNA提取試劑盒（購自QIAGEN公司）說明書方法提取血清RNA，并測定總RNA濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自QIAGEN公司）操作說明書，構(gòu)建20 μl反應體系，在Gene AmpPCR System 9700進行逆轉(zhuǎn)錄，設定程序：37℃ 60 min，95℃ 5 min。PCR試劑盒購自銳博生物，根據(jù)操作說明書配制20 μl反應體系，采用標準的三步法，預變性：95℃ 20 s，95℃10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個循環(huán)。根據(jù)公式2-△△Ct，計算血清 miR-335 水平。

1.3 肝動脈化療栓塞術（TACE）治療 對所有HCC患者行TACE治療，平均每例患者介入治療3.1次，并隨訪24個月。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以n（%）表示，采用x2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。取靈敏度與特異度之和最大為最優(yōu)診斷截斷點，計算受試者工作特征（ROC）曲線下面積（area under the curve，AUC），分析血清miR-335預測HCC患者預后的價值。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-335水平比較 HCC患者血清miR-335水平顯著低于乙型肝炎和肝硬化患者，也顯著低于正常人（P=0.001）；肝硬化和慢性乙型肝炎患者血清miR-335水平與正常人比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表 1）。

表1 各組血清miR-335水平（±s）比較

表1 各組血清miR-335水平（±s）比較

與正常人比，①P＜0.05；與肝癌組比，②P＜0.05

例數(shù) 血清miR-335水平肝癌 60 1.18±1.35①肝硬化 50 1.91±2.11②乙型肝炎 50 2.01±0.75②正常人 50 2.07±1.25

2.2 不同臨床和病理學特征HCC患者血清miR-335水平比較 存在門靜脈癌栓的HCC患者血清miR-335 水平顯著低于無癌栓患者（t=4.586，P＜0.001），死亡患者血清miR-335水平顯著低于生存患者（t=3.324，P＜0.001），而不同性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血清AFP水平高低患者，血清miR-335水平差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05，表 2）。

2.3 血清miR-335水平對HCC患者預后的判斷價值 本組HCC患者經(jīng)TACE治療后，隨訪2年，死亡13例（21.7%）。以血清miR-335水平小于或等于0.820為截斷點，判斷患者2年內(nèi)死亡的敏感性為83.0%，特異度為 100.0%（圖 1）。

表2 不同臨床和病理學特征HCC患者血清miR-335水平（±s）比較

表2 不同臨床和病理學特征HCC患者血清miR-335水平（±s）比較

例數(shù) 血清miR-335 t值 P值性別 男 42 1.12±1.27 1.16 0.251女 18 1.24±1.32年齡（歲） ≤56 38 1.08±1.16 1.471 0.147＞56 22 1.18±1.44腫瘤直徑（cm） ＞3 32 1.15±1.57 0.62 0.537≤3 28 1.24±0.92 TNM分期 Ⅰ/Ⅱ期 41 1.11±1.47 0.545 0.588Ⅲ/Ⅳ期 19 1.21±0.91淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無 45 1.11±0.94 0.19 0.85有 15 1.25±1.37癌栓 無 38 2.55±1.81 4.586 ＜0.001有 22 0.71±0.65血清AFP（μg/l） ≤20 28 1.15±1.31 0.61 0.545＞20 32 1.25±1.23預后 生存 47 1.19±10.83 0.179 0.039死亡 13 0.65±0.74

圖1 血清miR-335水平判斷HCC患者預后的受試者工作特征曲線

3 討論

HCC位居世界第五大常見腫瘤，80%～90%HCC患者主要是因為HBV和丙型肝炎病毒（HCV）感染引發(fā)的。因為HCC發(fā)病隱匿，病情進展迅速，當患者確診時大多已經(jīng)處于疾病的中、晚期，錯過了手術時機，即使行切除術后也很容易復發(fā)，5 a生存率低于10%。早期診斷的HCC患者，尤其是腫瘤直徑小于 2 cm的單結(jié)節(jié)腫瘤，其術后5 a生存率大約為70%。所以，盡早診斷對于后續(xù)的治療和改善預后十分重要。現(xiàn)階段，用于HCC篩查及監(jiān)測的主要方法是在影像學檢查的基礎上聯(lián)合實驗室檢查。影像學檢查在辨別早期腫瘤與良性病變，特別是直徑小于1 cm的HCC，CT和MRI檢查存在局限性。對于早期小病灶，細針穿刺也不容易成功，陰性結(jié)果可能還會造成漏診而失去早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的機會。

miRNA是高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，成熟miRNA與目的基因mRNA互補結(jié)合，導致mRNA降解或抑制其翻譯，可精細調(diào)控基因的表達[5]。近年來，人們越來越關注循環(huán)系統(tǒng)存在的miRNAs與HCC等腫瘤的關系，miRNAs作為基因調(diào)控分子在腫瘤的診斷、治療及預后方面的應用前景廣闊[6，7]。采集血液，檢測外周血 miRNAs，方法簡單、方便，更容易被患者及臨床醫(yī)生所接受[8]。此外，miRNA具有非常強的穩(wěn)定性，常溫放置超過24 h、反復凍融、強酸強堿等極端條件都不影響其穩(wěn)定性[9，10]。國外學者研究表明，HCC 癌組織 miR-21[11]、miR-224[12]水平上升，而在術后卻明顯下降，并且這些循環(huán)miRNA水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期存在相關性，提示其可能與患者預后有關。同時，這類miRNAs具有促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。但是，miRNA功能多樣，部分miRNAs可導致腫瘤細胞生長抑制、侵襲力減弱，如在HCC癌組織miR-101[13]和miR-145[14]水平降低。把這些miRNA前體轉(zhuǎn)染至HCC細胞株，可發(fā)現(xiàn)HCC細胞生長受抑、且呈劑量依賴性，細胞凋亡增加。miRNAs參與了HCC的發(fā)生和發(fā)展過程，其在HCC早期診斷和療效觀察中可能具有良好的應用前景。

相關研究顯示，多種腫瘤患者血清miR-335水平降低。通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織miR-335水平較癌旁良性前列腺組織明顯降低，提示這種miRNAs的丟失可能與前列腺癌的臨床發(fā)展有重要聯(lián)系[15]。腎透明細胞癌組織miR-155明顯下調(diào)，而且miR-155水平與腎透明細胞癌的大小呈正相關，說明miR-155可作為腎癌潛在的生物標志物[16]。在HCC患者，也有學者發(fā)現(xiàn)腫瘤組織miR-155水平顯著下降，尤其是伴有遠處轉(zhuǎn)移的HCC患者，其血清miR-155水平下降幅度更大[17]?？梢钥闯?，腫瘤患者血清不同miRNA水平變化差異較大。

本研究采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測了肝癌、乙型肝炎和肝硬化患者及正常對照組血清miR-335水平，結(jié)果顯示肝癌組血清miR-335水平較正常對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），也顯著低于CHB和肝硬化患者，說明miR-335水平在HCC患者異常下調(diào)，作為HCC潛在的生物標志物，可以輔助診斷早期無癥狀的HCC患者。通過對不同臨床和病理學特征的HCC患者血清miR-335水平比較發(fā)現(xiàn)，存在門靜脈癌栓患者血清miR-335水平顯著降低，死亡患者血清miR-335水平也顯著降低，說明血清miR-335水平過低，預示預后不良?？赡苁且驗閙iR-335的低水平促使了癌細胞的生長發(fā)育，侵襲血管，以至于血管功能和血液循環(huán)障礙，進而形成癌栓[18-20]。血清miR-335水平在不同性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者之間，差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

現(xiàn)階段，雖然血清AFP是國際上公認的HCC腫瘤標志物，大多數(shù)臨床醫(yī)師已習慣應用血清AFP診斷肝癌。然而，在診斷HCC方面的靈敏度大約為45%～70%，特異性為75%～95%，因為血清AFP水平在慢性肝炎和肝硬化患者也會升高，混淆了診斷[21，22]。本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，應用血清miR-335水平判斷接受TACE治療的HCC患者2年內(nèi)死亡的靈敏度和特異性均較好，值得進一步研究。