吳秀欣，張惠勇，張凱

據(jù)WHO報(bào)告，2010年全球新增活動(dòng)性結(jié)核患者880萬(wàn)例，死亡110萬(wàn)例[1]。迄今為止，中國(guó)是全球第二大結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家，世界上約12%結(jié)核病患者生活在中國(guó)?？菇Y(jié)核藥物可引起肝損傷，在聯(lián)合抗結(jié)核治療期間成為最常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一[2]。如果沒(méi)有及時(shí)診斷或予以合適的處理措施，嚴(yán)重肝損傷患者可發(fā)展至肝功能衰竭，導(dǎo)致死亡[3]。藥物本身的毒性[4]及其代謝中間產(chǎn)物[5]被認(rèn)為在抗結(jié)核藥物性肝損害（anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity，ATDH）發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)的肝損傷標(biāo)志物有氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、白蛋白和前白蛋白等，而新型的標(biāo)記物，如微小RNA（microRNA，miRNA）和三磷酸腺苷等也被逐步應(yīng)用于臨床。ATDH的發(fā)生存在著明顯的遺傳易感性[6]。miRNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，作為一種對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，在基因調(diào)控中有著非常重要的作用。既往有研究發(fā)現(xiàn)，ATDH患者血清miRNA水平顯著升高[7，8]，而在眾多miRNA 中，miRNA-4284與肝細(xì)胞發(fā)育、脂質(zhì)代謝、肝炎病毒感染、肝纖維化和肝癌發(fā)生等密切相關(guān)[9]。本研究采用高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了ATDH患者血漿miRNA-4284水平，旨在探討其診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月～2017年2月我院呼吸結(jié)核科收治的肺結(jié)核初治患者200例，男114例，女86例；平均年齡為（34.7±10.8）歲。肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2001年《肺結(jié)核診斷和治療指南》[10]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①入院行抗結(jié)核治療前肝功能正常，無(wú)血清學(xué)指標(biāo)異常；②入院時(shí)無(wú)肝炎相關(guān)病史或無(wú)病毒性肝炎標(biāo)志物陽(yáng)性；③入院前未大量服用其它可能致肝損害的藥物和飲酒等；④不伴有其它系統(tǒng)器質(zhì)性疾病。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意，詳細(xì)向患者及其家屬說(shuō)明實(shí)驗(yàn)相關(guān)內(nèi)容和研究目的，他們簽署知情同意書。

1.2 抗結(jié)核治療方法 采用 WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)6個(gè)月短程化學(xué)治療方案[11]，在治療過(guò)程中，均未預(yù)防性應(yīng)用護(hù)肝降酶藥物。ATDH的診斷標(biāo)準(zhǔn)：在服藥過(guò)程中患者血清ALT＞2倍正常值上限（ULN），或AST和TBIL水平升高＞2倍ULN，排除乙型肝炎、丙型肝炎、脂肪肝等可引起肝功能異常的疾病[11]。

1.3 血漿miRNA-4284檢測(cè) 采集外周靜脈血，抗凝，12000 r/m離心10 min，取上清，加入到1.5 ml離心管中，置于-80℃冰箱凍存。應(yīng)用miRNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取RNA。取血漿625μL，與等體積2×Denaturing Solution混勻，室溫下再加入1.25體積無(wú)水乙醇充分混勻。把混合液加入濾筒，離心30 s，棄去濾過(guò)液。重新加入miRNA洗滌液700 μL，離心約15 s，棄去濾過(guò)液。加洗滌液500 μL，沖洗濾筒2次,每次離心1 min，以清除濾筒內(nèi)殘留液體，更換收集管。95℃預(yù)熱無(wú)酶水，加入濾筒,離心30 s，收集洗脫液（含RNA），-20℃貯存。采用 Agilent Bioanalyzer 2100（Agilenttechnologies，SantaClara，CA，US） 對(duì) 總RNA行電泳質(zhì)量檢測(cè)。按照 miRNAcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 為 7.5μl， 即 dNTPs（100mmol/l） 0.075μl、反轉(zhuǎn)錄酶（50 u/μl） 0.5μl、10×Buffer 0.75 μl、酶抑制劑（20 u/μl） 0.1μl、去RNA酶H2O 0.075μl、特異反轉(zhuǎn)錄引物1.5μl、總RNA 4.5μl。混勻、短暫離心后，置于冰上5 min，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在20μl PCR反應(yīng)體系中，加特異性miRNA-4284 TaqMan檢測(cè)探針1μl、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl、基因表達(dá)MasterMix 10μl、去RNA酶水7μl和反轉(zhuǎn)錄得到的總RNA 5μl。反應(yīng)條件為：95℃ 5 s，95℃ 1 min，3 個(gè)循環(huán)；再 96℃ 5 s，60℃ 30 s，37個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用經(jīng)0.1%DEPC處理水4.4μl代替反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。于AB 17500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6 snRNA作為內(nèi)參行溶解曲線分析，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在檢測(cè)結(jié)束后，得到各樣本CT值，用實(shí)驗(yàn)組減去該組內(nèi)參CT值，得到△CT值；將ATDH 組所得△CT值再減去非 ATDH組△CT值，得到△△CT值，最后以 2-△△CT計(jì)算出各組miRNA-4284相對(duì)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以x±s表示，采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)miRNA-4284水平繪制受試者工作特征曲線，根據(jù)約登指數(shù)（約登指數(shù)＝敏感度+特異度-1）的最高臨界點(diǎn)確定血漿miRNA-4284水平診斷ATDH的最佳截?cái)帱c(diǎn)，計(jì)算診斷的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和正確率。

2 結(jié)果

2.1 肝損傷發(fā)生情況 在200例肺結(jié)核患者中，經(jīng)過(guò)6個(gè)月抗結(jié)核治療后，發(fā)生肝功能損傷70例（35.0%），其中肝細(xì)胞型24例，膽汁淤積型20例，混合型26例。ATDH患者血清肝功能指標(biāo)顯著升高（P＜0.05，表 1）。

表1 ATDH和非ATDH患者血生化指標(biāo)（±s）比較

表1 ATDH和非ATDH患者血生化指標(biāo)（±s）比較

與非ATDH比，①P＜0.05

例數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） ALP（U/L）ATDH肝細(xì)胞型 24 260.9±67.9① 250.4±57.2① 20.3±9.4① 60.4±3.2①膽汁淤積型 20 39.7±9.2 40.3±2.7 33.4±10.7① 80.6±8.3①混合型 26 149.8±63.7① 141.6±55.8① 29.8±10.1① 75.4±5.2①非 ATDH 130 32.5±4.3 39.8±3.9 18.4±2.5 50.8±0.4

2.2 ATDH與非ATDH患者血漿miRNA-4284水平比較 ATDH患者血漿miRNA-4284水平顯著高于非 ATDH 患者（P＜0.05）；在 ATDH 患者中，以膽汁淤積型血漿miRNA-4284水平最低，顯著低于其他兩型（P＜0.05，表 2）。

表2 兩組血漿miRNA-4284水平（±s）比較

表2 兩組血漿miRNA-4284水平（±s）比較

與非ATDH比，①t=3.7，P=0.007

例數(shù) miRNA-4284 ATDH 70 1.9±1.6①肝細(xì)胞型 24 2.0±1.2膽汁淤積型 20 1.7±0.7混合型 26 1.9±1.1非ATDH 130 0.9±0.6

2.3 血漿miRNA-4284診斷肺結(jié)核患者并發(fā)ATDH的效能情況 以血漿miRNA-4284水平=1.15為診斷ATDH的最佳截?cái)帱c(diǎn)，其曲線下面積為0.71（95%CI：0.43～1.45），診斷 ATDH 的敏感度為70.0%，特異度為69.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為77.8%，陰性預(yù)測(cè)值為67.4%，正確性為68.0%。

2.4 ATDH患者轉(zhuǎn)歸情況 在ATDH發(fā)生后，經(jīng)加用護(hù)肝治療3個(gè)月，70例患者血清肝功能指標(biāo)恢復(fù)至正常水平，而血漿miRNA-4284水平也降至（0.8±0.5）。

3 討論

本研究收集的200例肺結(jié)核初治患者，經(jīng)常規(guī)6個(gè)月抗結(jié)核治療后，出現(xiàn)肝功能損害患者有70例（35%），其ATDH的發(fā)病率與既往研究報(bào)道基本一致。既往研究[12，13]認(rèn)為，抗結(jié)核藥物肝臟毒性主要由于肝細(xì)胞的過(guò)敏性損傷或者中毒損傷，一般認(rèn)為，2個(gè)月以內(nèi)的不良反應(yīng)主要是超敏反應(yīng)，包括惡性、嘔吐、腹脹、納差、皮疹等，而2個(gè)月以后的臨床反應(yīng)則主要考慮是毒性反應(yīng)。這些藥物不良反應(yīng)不僅給醫(yī)生增加了結(jié)核病治療的難度，更是給患者增加了痛苦，往往使患者中斷治療，導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生和疾病復(fù)發(fā)。如何治療并防治肝毒性損傷，提高治療的成功率，成為了臨床工作中關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，一般在接受抗結(jié)核治療的同時(shí),需定期進(jìn)行肝功能檢測(cè)，同時(shí)需密切注意患者的一般情況。當(dāng)出現(xiàn)上述臨床/亞臨床癥狀時(shí)，應(yīng)引起高度的重視。

ATDH是抗結(jié)核藥物最常見(jiàn)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。近二十余年來(lái),結(jié)核病防治人員一直在致力于ATDH易感人群的研究,期望能從中尋找到某些特異性的預(yù)測(cè)因子。這項(xiàng)工作的重要意義顯而易見(jiàn)。如果在抗結(jié)核治療前對(duì)易感人群有很好的預(yù)測(cè)，那么，ATDH的發(fā)生將會(huì)減少甚至可以避免。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究較多的是藥物代謝酶基因多態(tài)性在ATDH發(fā)病中的作用,如 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT2）[14]和細(xì)胞色素P450（CYP2E1）[15]等。既往基因組學(xué)研究[16]表明，在細(xì)胞功能與代謝酶基因的調(diào)控方面，miRNA分子起關(guān)鍵作用，而ATDH患者體內(nèi)miRNA出現(xiàn)大量的過(guò)表達(dá)。本研究分析ATDH患者血漿miRNA-4284水平，研究結(jié)果顯示ATDH患者血漿 miRNA-4284的相對(duì)水平較非ATDH顯著升高（平均水平高2倍以上），提示miRNA-4284可能在 ATDH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要作用。既往研究[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-4284的功能涉及到物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體能量供給、細(xì)胞形態(tài)維持、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及炎性細(xì)胞黏附和免疫應(yīng)答調(diào)控等方面。miRNA-4284的重要靶基因主要有核受體結(jié)合因子2（NRBF2）、E2F 轉(zhuǎn)錄因子、Ras 相關(guān)蛋白 2A等，其中NRBF2是基因激活蛋白，可調(diào)控PI3KⅢ 活性，誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬，并阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用和肝損傷[18]。因此，血漿miRNA-4284水平升高可能增加了肺結(jié)核患者對(duì)ATDH的易感性。

研究進(jìn)一步分析miRNA-4284對(duì)ATDH的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，ATDH肝細(xì)胞型 和混合型患者血漿miRNA-4284水平顯著高于膽汁淤積型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.5，P=0.02）。血漿miRNA-4284水平診斷ATDH的最佳截?cái)帱c(diǎn)為1.15，其曲線下面積為 0.71（95%CI：0.43～1.45），診斷 ATDH 的敏感度為70.0%，特異度為69.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為77.8%，陰性預(yù)測(cè)值為67.4%，正確性為68.0%。上述結(jié)果表明血漿miRNA-4284水平在診斷ATDH方面具有一定的作用。國(guó)外一項(xiàng)前瞻性研究[19]表明，根據(jù)主要致病方式及臨床表現(xiàn)的不同將ATDH分為肝細(xì)胞型、膽汁淤積型和混合型，不同類型的ADTH所需要的治療也存在一定的差異。因此，早期區(qū)別不同ATDH類型，對(duì)于患者治療及預(yù)后均具有重要的臨床意義[20]。

近年來(lái)，雖然對(duì)于ATDH的研究涉及到各方面，但針對(duì)ATDH護(hù)肝治療的療效評(píng)估，目前尚無(wú)統(tǒng)一的檢測(cè)指標(biāo)。本研究給予ATDH組患者3個(gè)月護(hù)肝治療后，再次檢測(cè)血漿miRNA-4284水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者肝功能指標(biāo)恢復(fù)至正常水平，而血漿miRNA-4284水平也大幅降低。上述結(jié)果說(shuō)明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血漿miRNA-4284水平，對(duì)于判斷治療療效也有一定的幫助。

盡管本研究經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，但是尚未針對(duì)各亞型的ATDH進(jìn)行進(jìn)一步的研究。ATDH患者血漿miRNA-4284水平明顯升高，其在臨床診斷及療效評(píng)價(jià)等方面均有一定的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。