林 蘭，沈 敏，阮健文

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病[1，2]，該病的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明[3，4]。研究表明[5，6]，參與 AIH 肝損傷的有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞缺陷和自身反應(yīng)性T細(xì)胞功能障礙等，其中程序性死亡受體1（PD-1）是一種新發(fā)現(xiàn)的共刺激分子，對(duì)免疫細(xì)胞功能的發(fā)揮具有負(fù)性調(diào)控作用，與多種免疫性疾病的發(fā)生緊密相關(guān)[7，8]。AIH和慢性乙型肝炎患者肝組織均有PD-1表達(dá)。因此，進(jìn)一步了解AIH患者肝組織PD-1表達(dá)與肝組織炎癥分級(jí)和纖維化分期的關(guān)系尤為重要[9-11]。本文檢測(cè)了AIH患者肝組織PD-1表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年5月～2017年4月我科收治的AIH患者68例，男44例，女24例；年齡為36～57歲，平均年齡為（47.56±11.65）歲。其中有48例患者處于活動(dòng)期，20例經(jīng)免疫抑制劑治療后緩解。所有患者符合《自身免疫性肝炎診斷與治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，并在入組時(shí)經(jīng)簡(jiǎn)化的AIH評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估，也符合AIH的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除病毒性肝炎和肝硬化患者。另選擇同期入院的肝血管瘤手術(shù)患者13例，取得正常肝組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2 肝活檢和肝組織PD-1表達(dá)檢測(cè) 在超聲引導(dǎo)下使用BARD一次性全自動(dòng)活檢槍（河南達(dá)美澳醫(yī)療科技有限公司）行肝穿刺活檢術(shù)。取得肝組織約2.0 cm，包括匯管區(qū)在7個(gè)或以上，用4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片和HE染色，在光學(xué)顯微鏡（東陽(yáng)市義鵬光學(xué)儀器有限公司）下觀察。采用ABC法（試劑盒購(gòu)于上海謹(jǐn)研生物科技有限公司）檢測(cè)肝組織PD-1表達(dá)，抗PD-1抗體（1：200，武漢明皓生物科技股份有限公司產(chǎn)品）。隨機(jī)選取每張切片的高倍鏡視野，應(yīng)用HPIAS 1000病理學(xué)圖像分析儀（南京華欣分析儀器公司）檢測(cè)肝組織PD-1表達(dá)的平均吸光度值以及積分吸光度值，每例觀察5個(gè)視野，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)分析PD—l表達(dá)與肝功能指標(biāo)間的相關(guān)性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組自身免疫性肝炎患者血生化和血清學(xué)指標(biāo)變化的比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期患者血清TBIL、AST、ALT、GGT和ALP水平顯著高于緩解期患者，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）；活動(dòng)期患者血清GLO和IgG水平顯著高于緩解期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表 2）。

表1 兩組AIH患者血生化指標(biāo)（±s）比較

表1 兩組AIH患者血生化指標(biāo)（±s）比較

例數(shù) TBIL（μmol/L） AST（U/L） ALT（U/L） ALP（U/L） GGT（U/L）活動(dòng)期 48 72.1±48.9 243.1±170.4 345.3±217.7 154.3±94.6 86.5±43.5緩解期 20 14.8±4.2 28.3±8.7 27.6±8.8 73.3±51.3 71.3±27.3 t值 5.199 5.608 6.495 3.605 1.452 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 0.001 0.151

表2 兩組AIH患者血清球蛋白和免疫球蛋白水平（±s）比較

表2 兩組AIH患者血清球蛋白和免疫球蛋白水平（±s）比較

例數(shù) GLO（g/L） IgG（g/L） IgA（g/L） IgM（g/L）活動(dòng)期 48 34.3±11.3 23.2±7.5 3.4±1.8 1.8±1.1緩解期 20 30.7±10.2 11.7±4.6 3.1±1.4 1.6±1.2 t值 0.522 6.344 0.808 0.903 P值 0.044 0.023 0.422 0.378

2.2 肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 在48例活動(dòng)期AIH患者中，出現(xiàn)界面性肝炎者45例，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)者43例，單管破壞性炎癥者3例，而緩解期患者無(wú)界面性肝炎，匯管區(qū)無(wú)明顯壞死及淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 1、圖 2）。

2.3 AIH患者與健康人肝組織PD-1表達(dá)情況 自身免疫性肝炎患者肝組織PD-1表達(dá)顯著強(qiáng)于健康人（P＜0.05）；活動(dòng)期AIH患者肝組織細(xì)胞PD-1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于緩解期（P＜0.05，表3）。

圖1 緩解期AIH患者肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

圖2 活動(dòng)期AIH患者肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

表3 AIH患者與正常人肝組織PD-1表達(dá)（±s）比較

表3 AIH患者與正常人肝組織PD-1表達(dá)（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與緩解期組比，②P＜0.05

例數(shù) PD-1（%）AIH 68 13.6±6.9①活動(dòng)期 48 16.6±7.8①②緩解期 20 6.6±3.2①對(duì)照組 13 2.3±0.7

2.4 不同肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度患者肝組織PD-1表達(dá)比較 肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度嚴(yán)重組AIH患者肝組織PD-1表達(dá)顯著強(qiáng)于炎癥活動(dòng)度和纖維化程度輕組（P＞0.05，表4）。

表4 不同肝組織炎癥分級(jí)和纖維化分期患者肝組織 PD-1 表達(dá)水平（±s）比較

表4 不同肝組織炎癥分級(jí)和纖維化分期患者肝組織 PD-1 表達(dá)水平（±s）比較

與其他組比，①P＜0.05

例數(shù) PD-1 G0 20 9.24±2.35 G1～2 26 14.35±5.15 G3～4 22 19.32±5.49①S0 1 11.17±6.57 S1～2 33 14.67±7.4 S3～4組 19 18.98±5.99①

2.5 肝組織PD-1表達(dá)與血清肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，活動(dòng)期AIH患者肝組織PD-1表達(dá)陽(yáng)性率與血清TBIL（r=0.996，P＜0.001）、AST （r=0.989，P＜0.001）、ALT （r=0.995，P＜0.001）、ALP（r=0.998，P＜0.001）、GGT（r=0.995，P＜0.001）、GLO（r=0.996，P＜0.001）和 IgG（r=0.997，P＜0.001）均呈正相關(guān)；在緩解期 AIH 患者，肝組織PD-1表達(dá)陽(yáng)性率與血清TBIL（r=0.999，P＜0.001）、AST （r=0.999，P＜0.001）、ALT （r=0.999，P＜0.001）、ALP（r=0.999，P＜0.001）、GGT （r=0.999，P＜0.001）和 IgG（r=0.999，P＜0.001）呈正相關(guān)。

3 討論

目前，AIH的發(fā)病機(jī)制還有待研究[13-16]。有報(bào)道指出[17，18]，自身免疫異常是AIH的主要發(fā)病因素，一些自身抗原、誘發(fā)因子和遺傳傾向等因素相互作用，以至于打破了自身免疫耐受，導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的AIH和其他自身免疫性疾病的發(fā)生。相關(guān)研究指出[19]，PD-1在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，而PD-1與其配體結(jié)合后，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起負(fù)性調(diào)控作用。PD-1是CD28家族分子之一，以單獨(dú)的形式表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面。以其配體PD-1L結(jié)合后，有助于抑制T細(xì)胞的繁殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。相關(guān)研究證實(shí)，缺乏PD-1可導(dǎo)致免疫性疾病的發(fā)生。因此，PD-1能夠有效防止過(guò)度的炎癥反應(yīng)，避免免疫疾病的發(fā)生，對(duì)誘導(dǎo)和維持外周組織的免疫耐受起到重要的作用[20，21]。本文旨在觀察AIH患者肝組織PD-1表達(dá)情況及其與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。

有關(guān)研究指出，處于活動(dòng)期與緩解期的AIH患者各血清學(xué)指標(biāo)存在明顯差異。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期 AIH 患者血清 TBIL、ALT、AST、GGT、GLO 和IgG水平顯著高于緩解期患者。本研究還發(fā)現(xiàn)，AIH患者肝組織PD-1表達(dá)強(qiáng)度與血清TBIL、AST、ALT、ALP、GGT、GLO和IgG水平呈正相關(guān)。AIH患者肝組織PD-1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于肝血管瘤對(duì)照，與有關(guān)研究結(jié)果一致。活動(dòng)期AIH患者肝組織PD-1表達(dá)明顯強(qiáng)于緩解期患者。有報(bào)道肝組織PD-1表達(dá)隨著炎癥分級(jí)和纖維化分期增加而增強(qiáng)。本研究也顯示，肝內(nèi)炎癥分級(jí)嚴(yán)重的AIH患者肝組織PD-1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于炎癥分級(jí)輕的患者，肝內(nèi)PD-1表達(dá)與肝纖維化分期也存在同樣的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，在48例活動(dòng)期AIH患者中，出現(xiàn)界面性肝炎者45例，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)者43例，單管破壞性炎癥者3例，而在緩解期AIH患者中，無(wú)1例患者出現(xiàn)上述肝內(nèi)表現(xiàn)，與有關(guān)研究結(jié)果一致。