吳 靜，東保吉，吳 超

抗病毒治療慢性丙型肝炎（CHC）患者的療效受多種因素的影響，其中基線血清HCV RNA水平就很重要[1]。一般認(rèn)為，CHC患者血清病毒水平越低，則治療療效越好，治療效果也會(huì)受到HCV特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）活性的影響[2]，該特異性T細(xì)胞能夠清除HCV，提高治療效果[3]。本研究檢測(cè)了180例CHC患者外周血濾泡輔助性 T淋巴細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）表面程序性死亡受體-1（programmed cell death-1，PD-1）的表達(dá)情況，并檢測(cè)了血清白細(xì)胞介素21（IL-21）水平，以探討不同血清病毒載量的CHC患者外周血Tfh細(xì)胞表面PD-1表達(dá)的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年8月～2017年8月在我院就診的CHC患者180例，男119例，女61例；年齡為22～59歲，平均年齡為（47.31±9.65）歲；平均病程為（7.5±3.14）年。符合丙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)：血清HCV RNA≥3 lg copies/ml，人類白細(xì)胞抗原（HLA）-A2陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染、有自身免疫性疾病史、嗜酒史、應(yīng)用肝毒性藥物、應(yīng)用過口服抗病毒藥物、α-干擾素和免疫調(diào)節(jié)劑者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法 采用熒光定量PCR法檢測(cè)血清HCV RNA（試劑購于深圳市康百得生物科技有限公司）；采用ELISA法檢測(cè)血清抗-HCV（試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司）；使用日立7600全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；使用貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的FC500流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群、白細(xì)胞HLA-A2等位基因型、外周血Tfh和Tfh細(xì)胞表面PD-1陽性率（試劑盒均購于深圳市康百得生物科技有限公司）；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素21（IL-21，試劑盒購于武漢博士德生物有限公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組檢測(cè)指標(biāo)比較 根據(jù)血清HCV RNA水平進(jìn)行分組，結(jié)果血清低病毒載量組76例，3 lg copies/ml≤血清 HCV RNA＜6 lg copies/ml；高病毒載量組104例，血清HCV RNA≥6 lg copies/ml。高病毒載量組Tfh細(xì)胞表面PD-1陽性率顯著高于低病毒載量組（P＜0.01），而Tfh細(xì)胞百分比和血清IL-21水平均顯著低于低病毒載量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表 1）。

2.2 兩組外周血T、B細(xì)胞百分比比較 高病毒載量組外周血CD4+T、CD4+T/CD8+T比值和CD19+B細(xì)胞百分比均顯著低于低病毒載量組，而外周血CD8+T細(xì)胞百分比顯著高于低病毒載量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表 2）。

表1 兩組檢測(cè)指標(biāo)（%±s）比較

表1 兩組檢測(cè)指標(biāo)（%±s）比較

例數(shù) HCV RNA（lg copies/ml） Tfh細(xì)胞表面PD-1陽性 Tfh細(xì)胞百分比 IL-21（ng/L）低病毒載量 76 4.5±1.2 26.2±2.2 7.9±0.7 46.8±1.3高病毒載量 104 6.4±0.7 37.2±1.1 5.1±0.4 21.7±1.1 t 9.216 35.368 21.496 105.534 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 兩組外周血T、B細(xì)胞（±s）比較

表2 兩組外周血T、B細(xì)胞（±s）比較

例數(shù) CD4+T（%） CD8+T（%） CD4+T/CD8+T比值 CD19+B（%）低病毒載量組 76 51.1±4.6 24.0±3.1 3.3±0.2 16.7±3.9高病毒載量組 104 37.6±4.4 31.7±3.9 2.3±0.1 11.8±3.2 t 13.492 10.923 26.192 6.761 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 兩組外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面PD-1陽性表達(dá)百分比的比較 高病毒載量組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面PD-1陽性百分比均顯著低于低病毒載量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表 3）。

表3 兩組外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)（%±s）的比較

表3 兩組外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)（%±s）的比較

CD8+T細(xì)胞PD-1陽性低病毒載量組 76 10.1±2.3 6.3±2.2高病毒載量組 104 2.4±0.6 1.0±0.3 t 26.640 18.413 P＜0.01 ＜0.01例數(shù) CD4+T細(xì)胞PD-1陽性

3 討論

Tfh細(xì)胞主要在T淋巴細(xì)胞亞群中起作用，同時(shí)其本身還能夠通過分泌IL-21使病毒激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，使慢性乙型肝炎患者能夠獲得持續(xù)的抗病毒免疫[5]。Meissner et al研究表明，濾泡輔助性T細(xì)胞在慢性HCV感染性疾病發(fā)病過程中參與免疫反應(yīng)應(yīng)答[6]。Tfh表面存在一種PD-1受體，這種分子能抑制Tfh細(xì)胞表面分子的表達(dá)。在這種條件下，IL-21和HCV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）將無法更好地發(fā)揮作用，清除HCV的能力受到阻礙[7]。

慢性HCT感染患者外周血CD4+T細(xì)胞的效應(yīng)降低，而CD8+T細(xì)胞功能相對(duì)增強(qiáng)，該反應(yīng)變化與HIV感染患者類似[8]。T淋巴細(xì)胞發(fā)揮持續(xù)應(yīng)答需要接收到三個(gè)信號(hào)：一個(gè)是通過T細(xì)胞釋放的應(yīng)答因子傳遞；二是通過T細(xì)胞受體傳遞；三是通過T細(xì)胞表面表達(dá)抗原提呈細(xì)胞（APC）共刺激分子傳遞[9]。這三個(gè)信號(hào)缺一不可，缺失任一個(gè)都將導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙。在這么多條共同刺激信號(hào)的傳遞中，起負(fù)向協(xié)同作用的PD-1的刺激分子和它的配體B7-H1被認(rèn)為是與HCV感染時(shí)間持續(xù)時(shí)間有關(guān)[10]。我們前面提到了免疫細(xì)胞抑制性共刺激分子PD-1與它的配體（programmed death ligand-1，PD-L1）發(fā)生作用后會(huì)釋放出抑制免疫的信號(hào)，降低T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，T細(xì)胞反應(yīng)包括凋亡、抑制T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞走向衰竭。Mcgary et al發(fā)現(xiàn)CHC患者外周血T細(xì)胞PD-1百分比明顯增高[11]。Miller et al認(rèn)為PD-1百分比增加是因?yàn)镠CV核心蛋白與補(bǔ)體Clq R兩者之間發(fā)生相互作用的結(jié)果[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清高病毒載量的CHC患者HCV RNA和Tfh細(xì)胞表面PD-1陽性率均顯著高于低病毒載量組，而Tfh細(xì)胞百分比和血清IL-21水平均顯著低于低病毒載量組，表明核心蛋白會(huì)影響T細(xì)胞活化、增殖等，導(dǎo)致其功能出現(xiàn)異常。PD-1與PD-L1的結(jié)合作用被阻斷，導(dǎo)致PD-1功能無法發(fā)揮。在T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過程中存在某種能抑制信號(hào)傳導(dǎo)的病毒因素，如HCV核心蛋白的作用，使T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)抗原分子受挫，功能被阻斷，造成持續(xù)性的病毒感染。病毒為何能夠長(zhǎng)期在宿主器官中存在的原因可以從PD-1/PD-L1信號(hào)通路被阻斷得到部分解釋。

在一般情況下，機(jī)體外周血CD8+T淋巴細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞占比是維持一種動(dòng)態(tài)的平衡，維護(hù)機(jī)體免疫功能的基礎(chǔ)[13]。在過去的研究中發(fā)現(xiàn)，CHC患者外周血CD8+T細(xì)胞占比降低，CD4+T細(xì)胞占比升高，CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值增高，CD19+B細(xì)胞也增高，T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞表面PD-1表達(dá)增強(qiáng)，與健康人比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHC患者免疫功能發(fā)生了紊亂，T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡被打破，機(jī)體無法正常有效地清除HCV感染，進(jìn)而出現(xiàn)慢性感染[14]。CD19+B細(xì)胞占比的增高可能是因?yàn)槌掷m(xù)性的HCV抗原刺激，使B淋巴細(xì)胞不斷的增殖，功能增強(qiáng)[15]。究其原因，可能是因?yàn)橐韵聨c(diǎn)：①B淋巴細(xì)胞在HCV抗原的持續(xù)刺激下會(huì)不斷地刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-6和IL-13等細(xì)胞因子，造成慢性感染；②T淋巴細(xì)胞功能被抑制，比如Th1細(xì)胞被激活，產(chǎn)生多余的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）；③慢性化可能會(huì)因?yàn)橥淌杉?xì)胞、T淋巴細(xì)胞與NK細(xì)胞間相互作用而持續(xù)發(fā)生；④通過自身抗體的產(chǎn)生，發(fā)生免疫級(jí)聯(lián)效應(yīng)[16]。在患有B淋巴細(xì)胞缺陷的小鼠，無法產(chǎn)生自身抗體，而這種缺失會(huì)導(dǎo)致纖維化因子活性受到影響。本研究發(fā)現(xiàn)，高病毒載量組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面PD-1陽性百分比顯著低于低病毒載量組，提示慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表面PD-1的表達(dá)水平會(huì)因?yàn)檠宀《据d量的不同而不同。我們推測(cè)，在丙型肝炎病毒初次感染人體后，會(huì)避開機(jī)體的免疫防御機(jī)制使人體免疫力下降而不能清除病毒，這種影響包括降低CD8+T細(xì)胞的清除病毒能力，使CD4+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能受到抑制，促使細(xì)胞表面PD-1表達(dá)上調(diào)，結(jié)果就是不能及時(shí)有效地清除HCV感染，造成慢性丙型肝炎持續(xù)[17]。研究發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA水平、血清ALT水平、血清TBIL水平與外周血T淋巴細(xì)胞亞群表面PD-1表達(dá)存在相關(guān)性，但這種關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，可能與影響因素過多有關(guān)。通過檢測(cè)血清HCV RNA水平，可以判斷HCV自我復(fù)制能力，并可通過血清ALT水平等，來綜合判斷CHC患者的肝損傷程度[18，19]。CHC患者免疫功能受損的多個(gè)方面與艾滋病患者免疫功能受損相似[20]，只是程度沒有那么嚴(yán)重。檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平可以幫助評(píng)估患者免疫功能受損狀態(tài)，再結(jié)合對(duì)病毒復(fù)制和肝臟受損程度的評(píng)估，就可以推測(cè)患者免疫功能受影響的方方面面。