王 明，張 抒，李 明，文 君，鄭振江

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）分布于全身各組織和器官，在血液、乳汁、唾液、尿液、胃液等不同體液均可檢出，但不同部位HBV DNA水平和傳染性可能存在一定的差異。一般認為，血液HBV DNA水平最高，其傳染性也就最強[1]。上世紀70年代初國內(nèi)外學(xué)者就公認HBV主要通過非腸道方式傳播，但最新的臨床研究發(fā)現(xiàn)部分無輸血、注射或手術(shù)史的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者家屬，存在血清HBsAg陽性的家庭聚集現(xiàn)象，表明HBV的腸道傳播途徑可能一直被忽略。血清HBV DNA是判斷HBV感染和復(fù)制的重要指標。由于HBV可存在于膽汁、胃液和腸液內(nèi)，所以消化道液HBV檢測的陽性率也很高[2]，而目前糞便中是否存在HBV及糞便HBV DNA與肝功能的關(guān)系研究得還較少。肝腸起源于相同的胚層，因此它們的結(jié)構(gòu)和功能有許多相似之處而被稱之為“肝-腸軸”。部分腸道微生物及其代謝產(chǎn)物可以經(jīng)常達到肝臟，激活Toll樣受體/Nod樣受體（TLR/NLR）信號通路，導(dǎo)致肝臟炎癥，并可能與肝功能損傷程度相關(guān)[3]，但CHB患者腸道微生物種群的變化及其與HBV DNA的相關(guān)性尚未有報道。本研究檢測了CHB患者糞便HBV DNA，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年8月～2017年3月在我院就診的CHB患者73例，男46例，女27例；平均年齡（43.91±15.08）歲。符合2015年發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南的診斷標準[4]，入選患者血清HBsAg陽性＞1年、血清ALT≥正常值上限2倍、未接受過抗病毒治療、既往無消化道出血病史或糞潛血試驗陽性者。排除標準：合并甲型、丙型、丁型等其他肝炎病毒感染者、肝硬化或入組前3個月服用過可能導(dǎo)致肝損害的藥物、合并自身免疫性肝病、心腦腎等器官進展性疾病、妊娠或哺乳期婦女。受試者了解研究內(nèi)容并自愿簽署知情同意書。本研究得到本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意并書面批準。

1.2 檢測指標 晨起采集肘靜脈血4 ml，EDTA抗凝，-20℃保存。采用ELISA法檢測血清HBV標記物（上海江萊生物科技有限公司）；采用FQ-PCR法檢測血清HBV DNA水平（試劑盒由北京金豪制藥股份有限公司生產(chǎn)，檢測儀器為羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀并使用其配套軟件分析數(shù)據(jù)）；收集糞便400 mg，分為2份，分別保存于2個Eppendorf管（-80℃保存）。使用QIAmp DNA Stool kit試劑盒抽提糞便總DNA，采用Applied Biosystems熒光定量PCR儀及其配套試劑采用FQPCR法檢測HBV DNA。將糞便與緩沖液充分混勻，置于95℃ 孵育5 min，室溫靜置后加入蛋白酶K（蘇州奧維科生物科技有限公司），加入乙醇沉淀DNA，洗脫后備用。HBV DNA特異性引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，以提取的總DNA為模板進行兩輪反應(yīng)，取最后一輪PCR產(chǎn)物行0.5%瓊脂糖凝膠電泳。血清和糞便HBV DNA的定量單位為copies/ml（將糞便HBV DNA以檢測出的拷貝數(shù)乘以3.5×10-4換算成copies/mg[5]，檢測靈敏度為1×103copies/ml）。腸道菌群DNA的檢測：檢測種類包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌、梭菌屬、白色念珠菌、擬桿菌、普雷沃氏菌、瘤胃球菌等9種腸道菌群，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。以提取的糞便總DNA為模板，操作方法按照說明書要求進行，采用25μl反應(yīng)體系，擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，60℃ 1 min，72℃ 45 s，82℃延伸 5 s，循環(huán) 40 次，72 ℃ 10 min，結(jié)束。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用相應(yīng)的引物和模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，得到不同拷貝數(shù)量的熒光強度，于UVP凝膠成像系統(tǒng)（上海書俊儀器設(shè)備有限公司）中分析擴增結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用“Kolmogorov-Smirnov”法對計量資料行正態(tài)性檢驗，對符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料以百分率描述，組間比較采用x2檢驗，HBV DNA與不同變量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 在入組的73例CHB患者中，輕度21例，中度47例，重度5例。其中48例血清HBeAg陽性患者糞便和血清HBV DNA水平均顯著高于25例血清 HBeAg陰性患者（t=4.401，P=0.024；t=5.936，P=0.008，表 1）。

2.2 不同臨床分度CHB患者HBV DNA水平的比較 不同臨床分度CHB患者糞便和血清HBV DNA定量水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.3 相關(guān)性分析 糞便與血清HBV DNA呈正相關(guān)（r=0.61，P=0.002）；糞便HBV DNA與血清ALP和TBIL 呈負相關(guān)（r=-0.49，r=-0.54，P＜0.05），而血清HBV DNA與血清ALT或AST呈負相關(guān)（r=-0.46，P=0.023；r=-0.52，P=0.008，表 3）。糞便 HBV DNA與腸球菌呈正相關(guān)（r=0.49，P=0.005），而血清HBV DNA與乳酸桿菌呈負相關(guān)（r=-0.53，P＜0.001），其余腸道菌群與HBV DNA無明顯相關(guān)性（表4）。

表1 73例CHB患者實驗室指標（±s）

表1 73例CHB患者實驗室指標（±s）

與HBeAg陰性組比，①P＜0.05

ALT（U/L） 684.3±420.8 細菌 DNA （lgcopies/ml）AST（U/L） 493.3±335.1 雙歧桿菌 7.5±1.2 ALB（g/L） 38.3±5.5 乳酸桿菌 8.4±1.6 GGT（U/L） 131.1±72.7 腸桿菌 8.1±1.2 ALP（U/L） 112.6±58.4 腸球菌 6.9±1.0 TBIL（μmol/L） 42.6±42.9 梭菌屬 9.2±1.3糞便HBV DNA5.5±1.7 白色念珠菌 6.7±0.5（lg copie s/ml）HBeAg陽性（n=48） 5.9±1.6① 擬桿菌 9.7±1.2 HBeAg陰性（n=25） 5.0±1.9 普雷沃氏菌 9.5±1.8血清HBV DNA6.4±1.4 瘤胃球菌 5.9±0.8（lg copies/ml）HBeAg陽性（n=48） 7.2±1.6①HBeAg陰性（n=25） 6.1±1.3

表2 不同臨床分度CHB患者HBV DNA水平（lgcopies/ml±s）比較

表2 不同臨床分度CHB患者HBV DNA水平（lgcopies/ml±s）比較

血清糞便輕度 21 4.9±2.3 6.4±1.8中度 47 5.7±1.9 6.8±2.1重度 5 5.5±2.2 6.1±1.9 F 2.005 1.847 P 0.147 0.216

表3 HBV DNA與血生化指標的相關(guān)性分析

表4 HBV DNA與腸道細菌的相關(guān)性分析

3 討論

下消化道有大量正常微生物寄生和繁殖，腸道微生物在人體營養(yǎng)、免疫、抗感染和抗癌等多種生理過程中起重要作用，腸道還是誘導(dǎo)抑制性T淋巴細胞（主要分泌免疫抑制因子）分化成熟的關(guān)鍵場所[6]。肝功能不全患者幾乎都可出現(xiàn)腸道功能下降，肽聚糖等多種微生物代謝產(chǎn)物的移位還可以加重慢性肝病的進展[7]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)CHB患者腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌、假絲酵母菌水平明顯上升[8]，也有研究發(fā)現(xiàn)血清HBV載量與腸道滲透性、微生物群落構(gòu)成改變有關(guān)[9]。侵入人體而未被單核-吞噬細胞系統(tǒng)清除的HBV可到達肝臟或膽管、胰腺、淋巴結(jié)等肝外組織，同時HBV DNA對理化物質(zhì)的抵抗力較強，胃酸難以滅活。因此，CHB患者腸道通?？梢姶罅縃BV DNA復(fù)制，但CHB患者的糞便是否具有傳染性及其流行病學(xué)意義迄今未明確[10]。定量PCR檢測HBV復(fù)制水平操作簡便，同時敏感性和可重復(fù)性較高，隨著糞便DNA提取技術(shù)的進步，近年來糞便HBV DNA的定量檢測逐步應(yīng)用于臨床[11]。胃液和腸液均可檢測到HBV DNA。因此，HBV可能在腸道內(nèi)生存并復(fù)制[12]，但HBV與腸道菌群的相互影響目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)的糞便HBV DNA檢測的陽性結(jié)果進一步佐證了HBV在腸道內(nèi)復(fù)制的學(xué)說，CHB患者腸道內(nèi)存在HBV DNA。

血清HBeAg陽性患者處于病毒復(fù)制活動期和強傳染期。本組血清HBeAg陽性患者糞便HBV DNA載量顯著高于血清HBeAg陰性患者，表明血清HBV DNA水平高，病毒處于復(fù)制期時腸道內(nèi)HBV同樣處于復(fù)制活躍期[13]。也有研究認為CHB患者胃黏膜存在HBV感染，說明HBV不僅可以侵犯肝臟，也可能侵犯胃黏膜并進行復(fù)制[14]。當(dāng)完整的HBV顆粒進入腸腔后，其表面的HBsAg保護其不被胃液和腸液破壞，因此在排出體外的糞便中可以檢測出HBV DNA。由于前C區(qū)（G1896A）和BCP區(qū)（A1762T/G1764A）突變可能影響HBeAg的產(chǎn)生，HBeAg陰性患者血清HBV檢測也可以為陽性，而且HBV復(fù)制并未受到影響[15]，因此本研究HBeAg陰性患者血清和糞便HBV DNA均為陽性，表明HBV處于復(fù)制活動期，結(jié)果進一步支持血清和糞便HBV DNA對HBV的復(fù)制活動均有較高的提示意義。本研究發(fā)現(xiàn)在不同臨床類型的CHB患者HBV DNA定量無明顯差異，可能與本研究納入的重度CHB病例過少，亦可能由于重度患者經(jīng)過多年反復(fù)免疫損傷，使肝內(nèi)HBV DNA復(fù)制下降，其病情與HBV DNA復(fù)制水平的確切關(guān)系還有待進一步研究。

HBV感染導(dǎo)致的肝組織病理性損傷過程是病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果，目前對HBV DNA載量與肝臟損害程度的關(guān)系尚無確切的結(jié)論[16]。有研究認為血清HBV DNA載量與肝功能指標相關(guān)[17]，而本研究發(fā)現(xiàn)血清HBV DNA載量與血清ALT和AST呈負相關(guān)，表明HBV DNA水平與肝功能損害程度的關(guān)聯(lián)有待確定。同時，糞便HBV DNA與ALT和AST無關(guān)，而與ALP和TBIL呈負相關(guān)，我們認為糞便HBV DNA可能與膽管損傷有關(guān)，因此糞便和血清HBV DNA對消化系統(tǒng)損傷的提示作用不同。HBV感染的不同時期均可出現(xiàn)腸道菌群的改變，包括無癥狀HBV攜帶者、CHB和失代償型肝硬化，而有害菌群的上升和有益菌群的下降是最常見的改變，但HBV對腸內(nèi)微生物生態(tài)影響的原因尚不明確[18]。腸球菌科屬于腸道非優(yōu)勢菌群，通常在特定的環(huán)境下才能衍生出侵襲性而對人體造成傷害，而且CHB患者體內(nèi)的腸球菌科細菌可能異常增多[19]。本組腸球菌與糞便HBV DNA呈正相關(guān)，而血清HBV DNA與乳酸桿菌呈負相關(guān)，表明血清和糞便HBV復(fù)制分別與乳酸桿菌或腸球菌失衡的程度相關(guān)。因此，我們認為血清和糞便HBV DNA對腸道菌群紊亂的提示價值不一致，與有關(guān)研究[20]結(jié)果基本相同。

綜上所述，血清和糞便HBV DNA可反映HBV的復(fù)制水平，而對反映肝功能和腸道菌群紊亂的價值不同，但確切的關(guān)系尚有待進一步研究。