曹白鴿，劉沖霄，陳源文，董 艷

硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）是催化飽和脂酰輔酶A生成單不飽和脂酰輔酶A的關(guān)鍵酶[1-4]，主要在肝組織表達(dá)，在脂質(zhì)合成過程中發(fā)揮重要作用[5，6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用高脂飲食喂養(yǎng)母代非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）大鼠8周，其子代出生后肝組織表現(xiàn)為明顯的脂肪變性，SCD1基因表達(dá)明顯上調(diào)[7]。本研究在體外采用rIL-6刺激HepG2細(xì)胞，觀察了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成和SCD1基因的表達(dá)變化，并構(gòu)建了SCD1真核表達(dá)載體和小干擾（small interfering）RNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，觀察了SCD1表達(dá)變化對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 THP1細(xì)胞株和HepG2細(xì)胞株（由本院消化科惠贈(zèng)）；pEX-3（+）-SCD1真核表達(dá)質(zhì)粒和SiRNA-SCD1（上海吉瑪基因）；rIL-6細(xì)胞因子（Peprotech公司）；PMA（Sigma 公司）；Lipofectmin2000（Invitrogen公司）；甘油三酯酶法測定試劑盒（北京普利萊）；油紅粉末（Sigma公司）；兔抗人TNF-α單克隆抗體（ABclonal公司）；兔抗人IL-6單克隆抗體（ABclonal公司）；鼠抗人SCD-1單克隆抗體（Abcam公司）；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗（Abcam公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取THP1細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，分別在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將THP1細(xì)胞以2×105接種于6孔板（2 ml／孔），每孔以1：1000的比例加入0.1 mg/ml PMA誘導(dǎo)其貼壁，37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。隨機(jī)分為對(duì)照組和PA處理組，每組3個(gè)復(fù)孔，后者用0.3mM PA刺激24 h；rIL-6處理：將HepG2細(xì)胞以2×105接種于6孔板（2 ml／孔），37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分為對(duì)照組和rIL-6處理組，每組3個(gè)復(fù)孔，后者用40 ng/ml濃度的rIL-6刺激12 h，置于37℃培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。質(zhì)粒和small interfering RNA轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染前，將HepG2細(xì)胞以1×105接種于12孔板（1 ml／孔），37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（脂質(zhì)體+空質(zhì)粒）、SCD1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（脂質(zhì)體+SCD1重組質(zhì)粒）處理,每組3個(gè)復(fù)孔、陰性對(duì)照組（脂質(zhì)體+陰性對(duì)照）和small interfering RNA組（脂質(zhì)體+SiRNA-SCD1）處理，每組3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染前，棄去含有血清的培養(yǎng)基，用PBS沖洗1遍，加入Opti-MEM培養(yǎng)基（750 μl∕孔）。用Opti-MEM培養(yǎng)基100 μl分別稀釋質(zhì)粒1.5 μg和Lipofectmin 2000 3 μl，混勻、靜置5 min，再混合，靜置20 min，每孔加入混合液250 μl，混合均勻，同樣方法轉(zhuǎn)染small interfering RNA。然后，置于37℃培養(yǎng)箱中，6 h后更換成完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞脂代謝基因水平檢測 采用Q-PCR法，用Trizol提取處理后的HepG2細(xì)胞總RNA。測定各組RNA含量，各組取RNA 1000 ng，以37℃ 15 min和85℃ 5 s的條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，獲得的PCR產(chǎn)物用于擴(kuò)增。擴(kuò)增所用的引物序列見表1，引物由上海生工生物合成。

表1 PCR引物序列

1.4 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法，將膜與一抗孵育液于4℃冰箱過夜孵育；將膜置于HRP標(biāo)記的二抗（1：1000）稀釋液中，室溫振蕩孵育1 h。暗室中將膜加上ECL發(fā)光劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中檢測。

1.5 細(xì)胞甘油三酯（TG）含量檢測 收集rIL-6刺激后的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染24 h的HepG2細(xì)胞檢測，以每mg蛋白濃度校正TG含量，即為實(shí)際濃度。

1.6 HepG2細(xì)胞油紅O染色 在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)脂滴。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS v.20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)和one-way ANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂環(huán)境誘導(dǎo)THP1細(xì)胞炎癥因子合成增加 細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6 mRNA水平明顯增高，分別是對(duì)照組的1.86倍和11.42倍（P＜0.01，圖1A）；Western Blot檢測結(jié)果也顯示，細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01，圖1B）。

圖1 兩組THP1細(xì)胞炎癥因子基因及其蛋白表達(dá)情況

2.2 rIL-6促進(jìn)HepG2細(xì)胞SCD1水平增加 見圖2。

圖2 rIL-6上調(diào)HepG2細(xì)胞SCD1基因和蛋白表達(dá)

2.3 rIL-6促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成增加 見圖3。

圖3 rIL-6促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成增加

2.4 SCD1水平的改變對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 見圖4、圖5。

圖4 SCD1過表達(dá)細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因水平變化

圖5 SCD1下調(diào)細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因水平變化

2.5 SCD1表達(dá)改變對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成的影響見圖 6、圖 7。

圖6 SCD1過表達(dá)細(xì)胞脂質(zhì)合成的變化

圖7 SCD1下調(diào)細(xì)胞脂質(zhì)合成的變化

3 討論

當(dāng)肝臟內(nèi)脂肪含量增多時(shí)，肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞便啟動(dòng)自身的免疫防護(hù)機(jī)制，分泌炎癥因子[8-11]，可能通過激活下游炎癥小體來參與肝臟的病理過程[12]。

有研究發(fā)現(xiàn)rIL-6可上調(diào)高脂喂養(yǎng)的IL-6基因敲除小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)基因ACCα/β、FAS和SCD1水平，加重肝臟的脂肪變，但其具體機(jī)制尚不是十分清楚[13，14]。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的大鼠子代肝臟的脂肪含量較對(duì)照組增加，炎癥因子IL-6和SCD1基因表達(dá)均明顯上調(diào)，后者約是對(duì)照組的25倍。在此基礎(chǔ)上，本研究在體外采用rIL-6刺激HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞甘油三脂含量增加，脂肪酸合成基因SCD1上調(diào)，提示rIL-6誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成可能與SCD1表達(dá)增加有關(guān)。

SCD1是脂肪酸合成途徑中的重要基因，是甘油三酯合成過程中的限速酶。為進(jìn)一步明確IL-6促進(jìn)肝臟細(xì)胞脂質(zhì)合成增加與SCD1表達(dá)增加有關(guān)，本研究構(gòu)建SCD1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞SCD1表達(dá)，來觀察細(xì)胞脂質(zhì)合成功能的變化，研究結(jié)果顯示SCD1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，SCD1表達(dá)明顯增加，細(xì)胞內(nèi)脂滴較空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯增多，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的合成也明顯增加。然而，用IL-6刺激轉(zhuǎn)染SiRNA的HepG2細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)脂滴含量減少，甘油三酯的合成也明顯減少，這就為炎癥因子IL-6通過上調(diào)SCD1表達(dá)，進(jìn)而增加肝臟脂質(zhì)合成功能這一假設(shè)提供了證據(jù)。有研究報(bào)道，給予SCD1敲除小鼠高脂飲食后，肝臟內(nèi)LXR基因上調(diào)，脂肪酸合成減少，提示SCD1可通過調(diào)控肝臟LXR表達(dá)參與脂質(zhì)合成。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，抑制SCD1表達(dá)可以激活A(yù)MPK通路，進(jìn)而影響下游脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)。我們的研究中也發(fā)現(xiàn)，SCD1過表達(dá)后HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP1c和FASN相對(duì)水平均增加，而脂質(zhì)分解相關(guān)基因PPARα和ASCL3相對(duì)水平均降低。下調(diào)SCD1表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP1c和FASN相對(duì)水平也相應(yīng)的減少，而脂質(zhì)分解相關(guān)基因PPARα和ASCL3相對(duì)水平并未相應(yīng)的增加，提示SCD1基因可能主要通過調(diào)控脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。