施林領(lǐng) 陸秀芳 單海燕 伯樂 李海燕 奚星澍 滕云 茅彩萍

稽留流產(chǎn)(missed abortion)又稱過期流產(chǎn)，指胚胎或胎兒死亡后滯留宮內(nèi)未及時(shí)自然排出[1]，是產(chǎn)科常見的一種病理妊娠。近年來，稽留流產(chǎn)發(fā)病率逐漸上升，引起稽留流產(chǎn)的原因極其復(fù)雜[2-3]，主要包括染色體因素、免疫因素、生殖道感染、內(nèi)分泌紊亂、環(huán)境污染、氧化應(yīng)激、社會(huì)因素等。雖然關(guān)于稽留流產(chǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道并不少，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。因此，明確其病因?qū)ふ矣行У母深A(yù)措施對(duì)遺傳咨詢及再次妊娠有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究擬通過檢測(cè)稽留流產(chǎn)與正常人工流產(chǎn)者絨毛組織中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissueinhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)之間的相關(guān)性，探討導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的可能病因及發(fā)病機(jī)制，為臨床診療提供科學(xué)理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選擇2015年11月至2016年5月期間就診于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院計(jì)劃生育門診和蘇州市立醫(yī)院北區(qū)婦產(chǎn)科的30例稽留流產(chǎn)患者作為實(shí)驗(yàn)組，患者既往月經(jīng)規(guī)律，經(jīng)人絨毛膜促性腺激素及B超動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)證實(shí)為稽留流產(chǎn)，患者平均年齡(28.0±5.1)歲，孕齡(58.4±13.7) d；同時(shí)選擇30例自愿要求終止妊娠的有正常生育史的同期早孕健康婦女作為對(duì)照組，平均年齡(29.2±4.8)歲，孕齡(60.8±12.4) d。

所有納入對(duì)象滿足的入選標(biāo)準(zhǔn)為(1)既往均無高血壓、滋養(yǎng)細(xì)胞疾病、惡性腫瘤、內(nèi)分泌及免疫性疾病等，且所有稽留流產(chǎn)均排除染色體因素所致；(2)婦科檢查均排除陰道炎、宮頸炎；(3)超聲提示無子宮內(nèi)膜息肉、子宮黏膜下肌瘤、卵巢囊腫等；(4)孕前3個(gè)月及孕期均未服用藥物，均未接觸毒物及放射線。本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院和蘇州市立醫(yī)院北區(qū)的醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意并簽訂知情同意書。兩組患者的一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可比性。

二、方法

于清宮術(shù)時(shí)獲取兩組患者的絨毛組織，在無菌及滅活RNA酶條件下，采集稽留流產(chǎn)和正常早孕婦女的流產(chǎn)絨毛標(biāo)本，通過焦磷酸二乙酯處理過的生理鹽水洗凈去除粘液和血液，濾紙去除表面水分，將剔除蛻膜組織后所得的組織置于滅活 RNA 酶的凍存管中，置-80℃冷凍保存。

1.提取組織標(biāo)本RNA：取凍存的待測(cè)絨毛組織約100 mg置于研缽中，加入適量液氮研磨至粉狀，RNA提取操作嚴(yán)格按照RNeasy Mini Kit(50)(Qiagen公司，批號(hào)：74104，生產(chǎn)時(shí)間：2016年4月)說明書要求進(jìn)行，完成后用Qubit熒光定量(Thermo Fisher公司，型號(hào)：Q33226)測(cè)定RNA濃度，RNA濃度= A260×稀釋倍數(shù)×40÷1000(ug/μl)。

2.RNA的逆轉(zhuǎn)錄：采用PrimeScript RT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)：RR047A，生產(chǎn)時(shí)間：2016年6月)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照說明書要求，根據(jù)不同樣本濃度進(jìn)行相應(yīng)換算，然后向體系中加入相應(yīng)RNA(加入量<500 ng/10 ml)，操作均在冰上進(jìn)行。37℃ 15 min，85℃ 5s，產(chǎn)物置4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

3.mRNA表達(dá)的檢測(cè)：采用RT-PCR檢測(cè)兩組患者絨毛組織中NFκB (NFκB p50亞基的調(diào)控基因NFκB1和NFκB p65亞基的調(diào)控基因RelA)、TGF-β1、TIMP-1、MMP-9等相關(guān)基因表達(dá)。采用ABI7500(Thermo Fisher公司，型號(hào)：4351105)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，且在完成后對(duì)相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。進(jìn)行的PCR反應(yīng)均采用Premix ExTaq PCR反應(yīng)液(TaKaRa公司，批號(hào)：RR820L，生產(chǎn)時(shí)間：2016年6月)，反應(yīng)體系及參數(shù)嚴(yán)格參照說明書。反應(yīng)條件為 95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s、95℃ 15 s； 60℃ 1min 共40個(gè)循環(huán)。均用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)RT-PCR的產(chǎn)物量進(jìn)行校正，按比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后與待測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，且均采用不同批次的標(biāo)本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。采用相對(duì)定量法計(jì)算mRNA的表達(dá)量，ΔC表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔC=C(目的基因)-C(內(nèi)參基因)，ΔC’=ΔC(目的基因)-ΔC(標(biāo)準(zhǔn)值)，目的基因的相對(duì)總量為2-ΔC’。引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)及合成，見表1。

表1 RT-PCR引物序列

4.蛋白表達(dá)的檢測(cè)：采用Western Blot法檢測(cè)患者絨毛組織中NFκB(p50亞基和p65亞基)、TGF-β1、TIMP-1、MMP-9的蛋白表達(dá)。絨毛組織蛋白質(zhì)的提取，按照Trizol試劑盒(Gibco BRL公司，批號(hào)：15596026，生產(chǎn)時(shí)間：2016年7月)要求操作，所獲蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，再用5%小牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加一抗(抗體稀釋度為1:1 000，內(nèi)參抗體稀釋度為1:2 000),于4℃保存過夜，次日取膜棄一抗，加入適量TBST洗滌PVDF膜，重復(fù)3次，每次10 min，加二抗(稀釋度為1:2000)室溫下1 h后，棄二抗，再更換TBST洗滌3次，每次10 min，而后行曝光等處理并用imageJ軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

5.血清TGF-β1的檢測(cè)：囑納入對(duì)象術(shù)前禁食12 h，采集清晨空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 ml于EATD管內(nèi)，靜置后離心并分離血清，于-80℃冰箱保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清TGF-β1，試劑盒購(gòu)自R&D Systems公司(批號(hào)：DY010，生產(chǎn)時(shí)間：2016年8月)。

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料分析

兩組患者的月經(jīng)周期均規(guī)律，均排除因染色體異常導(dǎo)致的流產(chǎn)。兩組患者的年齡、停經(jīng)時(shí)間等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有患者均無器質(zhì)性疾病。肉眼辨認(rèn)所有標(biāo)本并選出典型的絨毛組織。

二、兩組患者血漿TGF-β1水平檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組血液中TGF-β1的平均水平為(119.34±17.81) pg/L，低于對(duì)照組的(180.75±26.28) pg/L，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 血漿TGF-β1檢測(cè)結(jié)果

Note:Compared with the control group,*P<0.05

三、MMPs通路中關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組絨毛組織NFκB1、TGF-β1和TIMP-1的mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而RelA的mRNA表達(dá)水平，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組絨毛組織MMP-9的mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

四、MMPs通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組絨毛組織MMP-9蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組絨毛組織TGF-β1和NFκB p50亞基(NFκB1基因調(diào)控)、TIMP-1的蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、圖3。

討 論

相對(duì)于自然流產(chǎn)而言，稽留流產(chǎn)中胚胎停育或死亡后不能及時(shí)從機(jī)體排出，易使患者發(fā)生凝血功能障礙，稽留流產(chǎn)的致病因素至今尚不甚明確，這些未明確的危險(xiǎn)因素可能導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的再次發(fā)生，具有更大的危害性[4]。因此，稽留流產(chǎn)病因和發(fā)病機(jī)制的探討對(duì)其預(yù)防和治療具有重要的臨床意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是存在于基質(zhì)中降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重要水解蛋白酶，在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblast cell，EVT)入侵內(nèi)膜基質(zhì)中起關(guān)鍵作用，其天然的組織型抑制分子基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinase inhibitors，TIMPs)是有序降解和重塑ECM的關(guān)鍵分子[5]。既往研究報(bào)道[6-8]，胚胎植入過程中MMPs的作用主要包括：(1)參與子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)和血管生成，促進(jìn)胚胎著床的同時(shí)供給著床后所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；(2)參與胚胎著床過程，通過對(duì)蛻膜ECM的降解，防止因胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的突然侵襲引發(fā)出血，從而使胎囊與蛻膜脫離導(dǎo)致流產(chǎn)。MMPs和TIMPs能由胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞與蛻膜分別合成，在正常生理狀態(tài)下，兩者互相制衡，但MMPs和TIMPs之間的平衡在某些病理狀態(tài)下也會(huì)失調(diào)，從而影響胚胎著床與生長(zhǎng)[9]。此外，蛻膜因?yàn)榍忠u過度的胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞可能發(fā)生過度降解，從而導(dǎo)致妊娠早期出血甚至流產(chǎn)。其中，MMP-9在形成胎盤與建立子宮胎兒循環(huán)方面的作用至關(guān)重要。通過RT-PCR檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的流產(chǎn)絨毛組織中均有MMP-9的表達(dá)。本研究中，實(shí)驗(yàn)組MMP-9的mRNA及其蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，而TIMP-1的表達(dá)低于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究結(jié)果提示，稽留流產(chǎn)的發(fā)生可能與MMP-9/ TIMP-1的平衡被破壞有關(guān)，為了明確導(dǎo)致MMP-9表達(dá)升高及TIMP-1表達(dá)降低的原因，本研究進(jìn)一步對(duì)其信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探究。

圖1 MMPs通路中相關(guān)因子mRNA表達(dá)Figure 1 mRNA expression of related genes in MMPs pathway

圖2 蛋白印跡條帶原圖Figure 2 Original stripe map from Western blot

圖3 MMPs通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of related proteins in MMPs pathway

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子,在胚胎著床、ECM產(chǎn)生、血管生成、細(xì)胞增殖分化及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)等方面均起著重要的作用。文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，TGF-β1不僅可誘導(dǎo)TIMP-1的產(chǎn)生，還能調(diào)控MMP-9及其抑制物TIMP-1的侵襲力。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在妊娠合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、絨毛及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞以及各期胎盤組織等中均有表達(dá)[12]。本研究中，實(shí)驗(yàn)組TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TGF-β1、TIMP-1與MMP-9可能具有一定相關(guān)性。妊娠早期，TGF-β1水平的異常降低可能引起TIMP-1的表達(dá)降低，從而打破MMP-9/TIMP-1的平衡；MMP-9表達(dá)的異常增加，使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過深，蛻膜ECM過度降解，胚胎植入失敗以及胎盤形成不良，最終導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。這表明TGF-β1對(duì)早期胚胎穩(wěn)定著床可能有一定的調(diào)控作用。

NF-κB可調(diào)控TGF-β1的合成并促進(jìn)其表達(dá)。TGF-β1的活化因子為組織轉(zhuǎn)谷氨酰酶，其啟動(dòng)子中含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。NF-κB活化后由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核發(fā)生核轉(zhuǎn)位，參與TGF-β1的合成。NF- κB 的活化由其抑制亞單位IκB的磷酸化所啟動(dòng)，IκB蛋白的降解激活NF-κB的p50亞單位(NFκB1基因)和p65亞單位(RelA基因)，使其得以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，MMP-9也為NF-κB 的靶基因。既往研究證實(shí)[13-14]，MMP-9基因的啟動(dòng)子側(cè)翼調(diào)控區(qū)存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB與其結(jié)合后，能增強(qiáng)其啟動(dòng)子的活性，從而上調(diào)MMP-9 的表達(dá)，加速ECM 的降解。本研究中，實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中NFκB1和RelA的mRNA水平，及對(duì)應(yīng)的p50和p65蛋白的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，而MMP-9的mRNA和蛋白的表達(dá)水平則高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，在NF-κB和TGF-β1均低表達(dá)時(shí)，NF-κB對(duì)MMP-9生成的促進(jìn)作用大于TGF-β1對(duì)MMP-9生成的抑制作用，可能是由于過度表達(dá)的MMP-9消耗了大部分NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，余下小部分NF-κB與TGF-β1啟動(dòng)子結(jié)合，懸殊的作用效果導(dǎo)致MMP-9表達(dá)異常升高，打破了ECM合成與降解的平衡，使得滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過深引起蛻膜ECM過度降解。

綜上所述，NF-κB表達(dá)水平的降低，引起TGF-β1水平的降低，可影響MMP-9 /TIMP-1平衡的調(diào)控，且MMP-9水平的異常升高，使蛻膜ECM過度降解，引起胚胎植入失敗和不良胎盤形成，最終導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。本研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探討稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的思路和診療策略。