張江寧，楊春，張玲，丁衛(wèi)英

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,太原 030031)

紅曲是紅曲霉發(fā)酵制成的產(chǎn)品的總稱(chēng)，國(guó)內(nèi)外大量研究表明由于紅曲含有洛伐他汀成分，因此具有明顯的降膽固醇和降血脂的功效[1]，但是紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的桔青霉素是對(duì)人體有害的真菌毒素，靶器官為人體腎臟，具有致癌致畸作用。因此，如何通過(guò)提高洛伐他汀、降低桔青霉素含量具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究紅曲米發(fā)酵制備過(guò)程中碳源、氮源、碳氮比例、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始含水量、接種量、pH值對(duì)發(fā)酵過(guò)程中洛伐他汀、桔青霉素積累規(guī)律的影響，建立了提高洛伐他汀、降低桔青霉素含量的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、磷酸、95%乙醇、洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品、桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品。

DIONEX UltiMate 3000 UHPLC+focused高效液相色譜儀；JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及試驗(yàn)方法

PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，紗布過(guò)濾，滅菌，備用。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：原料20 g裝入250 mL三角瓶中，蒸至物料顆粒分散、滅菌。

紅曲米制作：挑取1環(huán)保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，于31 ℃恒溫箱中擴(kuò)大培養(yǎng)1周，接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)期間通過(guò)補(bǔ)加水使物料的含水量保持在40%～50%，于40 ℃烘干備用。

1.2.2 洛伐他汀UHPLC測(cè)定方法[2]

發(fā)酵樣品處理[3-5]：將發(fā)酵樣品碾磨，水浴萃取，取5 mL萃取液微濾。

UHPLC條件：色譜柱名稱(chēng)：Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)。

1.2.3 桔青霉素含量測(cè)定方法[6，7]

發(fā)酵樣品處理：固態(tài)紅曲樣品，40 mL TEF溶液，超聲提取，40 ℃真空濃縮至干后加入60 mL甲醇溶解，進(jìn)行HPLC分析。

UHPLC檢測(cè)條件：色譜柱名稱(chēng)：Thermo Scientific Hypersil GOLD (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)，流動(dòng)相A為純水，流動(dòng)相B為乙腈。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

碳源是紅曲霉生長(zhǎng)代謝重要的物質(zhì)之一，分別加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中并制成紅曲米進(jìn)行比較，不同的附加碳源對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同碳源對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及 桔青霉素含量的影響

由圖1可知，添加20%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作為附加碳源時(shí)都能不同程度地增加桔青霉素的含量，其中果糖作為附加碳源時(shí)洛伐他汀的產(chǎn)量最高，達(dá)到14.3 mg/g，此時(shí)，桔青霉素含量較低，與其余幾種碳源有顯著差異，蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作為添加碳源時(shí)，桔青霉素含量較高，因此果糖可以作為最適碳源。

2.2 果糖濃度對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

圖2 果糖濃度對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及 桔青霉素含量的影響

由圖2可知培養(yǎng)基中不同濃度的果糖。分別選取果糖添加量為20%，30%，40%，50% 4個(gè)水平。果糖添加量小于30%時(shí)，洛伐他汀的產(chǎn)量不斷增加。果糖量增加，洛伐他汀含量逐漸降低，桔青霉素的含量變化不大，綜合考慮洛伐他汀的產(chǎn)量和原料利用率，最終選用濃度為30%的果糖作為培養(yǎng)基碳源添加量。

2.3 不同氮源對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

本實(shí)驗(yàn)選用6種氮源大豆粉、蛋白胨、酵母膏、NaNO3、NH4NO3與NH4Cl分別按10%添加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中并制成紅曲米進(jìn)行比較，檢測(cè)洛伐他汀及桔青霉素的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同氮源對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及 桔青霉素含量的影響

由圖3可知，以大豆粉為附加氮源時(shí)，洛伐他汀的產(chǎn)量最高，桔青霉素含量較低，與其他幾種氮源相比差異比較明顯；蛋白胨作為添加氮源時(shí)，洛伐他汀的產(chǎn)量較高，但是對(duì)桔青霉素合成刺激作用最明顯，含量最高；酵母膏作為添加氮源時(shí)，雖然含量不高，但是洛伐他汀的產(chǎn)量處于低位；NaNO3、NH4NO3與NH4Cl對(duì)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響不顯著。

2.4 氮源濃度對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

培養(yǎng)基中不同濃度的大豆粉對(duì)洛伐他汀及桔青霉素的影響情況見(jiàn)圖4。

圖4 氮源濃度對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及 桔青霉素含量的影響

由圖4可知，分別選取大豆粉添加量為5%，10%，15%，20% 4個(gè)水平。大豆粉的添加量為10%時(shí)，對(duì)洛伐他汀的產(chǎn)生積累有較大影響，達(dá)到15.3 mg/g，對(duì)桔青霉素的產(chǎn)生能力影響不大，因此確定大豆粉的添加量為10%。

2.5 初始pH值對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

圖5 初始pH值對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

由圖5可知，分別用pH為3，4，5，6，7，水呈酸性時(shí),有利于抑制雜菌的生長(zhǎng),但同時(shí)酸性過(guò)高，導(dǎo)致合成洛伐他汀相對(duì)減弱。隨著pH 值增加，洛伐他汀的含量增大，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，洛伐他汀的產(chǎn)量達(dá)到最大值，桔青霉素含量較低。

2.6 發(fā)酵溫度對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

分別選用發(fā)酵溫度為 25，30，35，40，45 ℃發(fā)酵12天，對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

由圖6可知，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，直接影響了菌絲生長(zhǎng)及洛伐他汀的生成量。當(dāng)溫度高于35 ℃后，洛伐他汀及桔青霉素產(chǎn)量下降，說(shuō)明溫度對(duì)洛伐他汀及桔青霉素的合成途徑有重要影響，而不僅僅是對(duì)紅曲霉細(xì)胞的生長(zhǎng)影響，因此最適合溫度為30 ℃。

2.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

分別研究發(fā)酵時(shí)間為3，6，9，12，15天時(shí)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響見(jiàn)圖7。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)9天時(shí)，洛伐他汀的積累量基本達(dá)到最大值，之后下降。桔青霉素發(fā)酵至第6天時(shí)迅速上升，因后期桔青霉素累積過(guò)快，前期洛伐他汀含量較低，因此綜合考慮，選擇培養(yǎng)時(shí)間為9天。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究碳源種類(lèi)及濃度、氮源種類(lèi)及濃度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、pH值對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素含量的影響，結(jié)果表明果糖作為附加碳源時(shí)洛伐他汀的產(chǎn)量最高，桔青霉素的含量較低；有機(jī)氮源洛伐他汀產(chǎn)量大于無(wú)機(jī)氮源，蛋白胨洛伐他汀的產(chǎn)量較高，對(duì)桔青霉素合成刺激作用也明顯；隨著發(fā)酵初始pH值增加，洛伐他汀的含量增大，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，洛伐他汀較高，桔青霉素含量較低，當(dāng)pH值繼續(xù)升高時(shí)，洛伐他汀產(chǎn)量下降；當(dāng)發(fā)酵溫度高于35 ℃后，洛伐他汀及桔青霉素產(chǎn)量下降；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到9天時(shí)，洛伐他汀的積累量基本達(dá)到最大值，之后下降，桔青霉素發(fā)酵至第6天時(shí)迅速上升。