王亞敏 ， 謝夢(mèng)洲 ，3，張超文 ，陳光宇 ，瞿昊宇 ，宋毓?jié)?，朱建平

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410208；3.抗腫瘤中藥創(chuàng)制技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410007）

湯劑的形式既符合中國(guó)傳統(tǒng)的健康飲食方式，又是中醫(yī)傳統(tǒng)有效服藥劑型，特別是對(duì)于補(bǔ)益類(lèi)中藥來(lái)說(shuō)，湯劑熱服使熱氣推行更有利于發(fā)揮補(bǔ)益作用，參山固體飲料是將藥食同源中藥和藥食兩用真菌有機(jī)結(jié)合，既能以巧妙的配比充分發(fā)揮中藥復(fù)方與菌湯獨(dú)特鮮美風(fēng)味，又能通過(guò)中藥提取工藝優(yōu)化和菌湯熬煮工藝的優(yōu)化充分發(fā)揮中藥復(fù)方與藥食用真菌的功效，參山固體飲料在選方配伍上以健脾益腎法為依據(jù)，以減輕腫瘤患者因癌性疲乏癥狀為目標(biāo)，選藥均為藥食同源藥材，以人參大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾養(yǎng)胃，山藥益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾肺腎為君，茯苓利水滲濕、健脾安神，枸杞子、桑葚補(bǔ)益肝腎、滋陰生津?yàn)槌?，共奏健脾利濕、補(bǔ)腎養(yǎng)陰之效，玫瑰花疏肝解郁、活血行氣，再與既能健脾益氣、又鮮香濃郁的藥食兩用真菌配合，使中藥復(fù)方提取物和食用菌提取物在功效和風(fēng)味上相輔相成，既能固護(hù)患者胃氣、調(diào)補(bǔ)氣血，也能增進(jìn)患者食欲，提高患者對(duì)藥膳類(lèi)產(chǎn)品的接受度。由于中藥復(fù)方中人參、桑葚、玫瑰花的醇溶性成分人參皂苷、白藜蘆醇、黃酮和水溶性成分多糖等皆有抗腫瘤、增加免疫力的活性[1-2]，而茯苓、枸杞子、山藥的活性成分主要為多糖類(lèi)屬于水溶性成分[3-4]，研究采用先醇提人參、桑葚、玫瑰花，醇提藥渣與茯苓、枸杞子、山藥一并水提，可以最大程度地提取中藥中的有效活性成分，以達(dá)到提高功效的目的。主要研究了參山固體飲料的提取工藝，獲得最優(yōu)提取參數(shù)，以期為中試和工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)，包括G1316A型四元梯度泵、G1313A型標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型恒溫箱、G1314A型紫外檢測(cè)器、Agilent Chemstation色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；UV9100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司產(chǎn)品；YP-B5001型電子天平，上海光正醫(yī)源儀器有限公司產(chǎn)品；RHP-400型高速多功能粉碎機(jī)，浙江永康市榮浩工業(yè)有限公司產(chǎn)品；SHH.W21型電子三用水箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；YJD20型老藥師常溫煎藥機(jī)，長(zhǎng)沙市卓成醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；RE-200013型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 藥材及試劑

人參（人工種植）、桑葚、玫瑰花（重瓣紅玫瑰）、枸杞子、茯苓、山藥等藥材，購(gòu)于老百姓大藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授鑒定符合2015版《中國(guó)藥典》一部項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-200726） 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-200921），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)：110702-200925），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-201506），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他HPLC用試劑皆為色譜純；5%苯酚、濃硫酸、乙醚、無(wú)水乙醇等比色用試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸比色法測(cè)定參山固體飲料水提液中多糖的含量

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品約0.025 g，精密稱(chēng)定，置250 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 參山固體飲料水提液供試品溶液的制備[5-6]

精密移取各工藝條件下制得的醇提樣品液（相當(dāng)于生藥量0.5 g），加乙醚100 mL加熱回流1 h，靜置，放冷，小心棄去乙醚液，殘?jiān)盟∩蠐]盡乙醚。加入80%乙醇100 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過(guò)，濾渣與濾器用80%乙醇30 mL分次洗滌，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流2 h。趁熱濾過(guò)，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至250 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得供試品1；吸取2 mL供試品1置10 mL試管中，加水至刻度線(xiàn)，得供試品2。精密吸取1 mL供試品2，加入1 mL蒸餾水，5%的苯酚1 mL，5 mL濃硫酸，搖勻，室溫置10 min，于40℃水浴加熱15min，冷卻至室溫，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

2.1.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液和參山固體飲料中藥復(fù)方水提樣品溶液1 mL，按照2.1.2項(xiàng)下方法于波長(zhǎng)400～600 nm處分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果對(duì)照液和供試液最大吸收波長(zhǎng)皆在490 nm，故選擇490 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密吸取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中并加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，各再精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，于室溫下放置10 min，置40℃水浴加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，于波長(zhǎng)490 nm的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度對(duì)無(wú)水葡萄糖溶液濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性方程：Y=0.017 176+0.043 539X，R=0.992 9。

2.1.5 方法學(xué)考查

儀器精密度RSD為1.96%，供試品溶液在6 h內(nèi)吸光度穩(wěn)定，測(cè)定應(yīng)在6 h內(nèi)完成。重復(fù)性試驗(yàn)RSD為4.831%，加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，參山固體飲料部分藥材的醇提樣品液中多糖平均回收率為102.3%，RSD為2.218%。

2.2 HPLC法測(cè)定參山固體飲料醇提液中人參皂苷Rg1，Re，Rb1的含量

2.2.1 色譜條件[7-8]

Ultimate 3000型色譜柱；固定相為C18烷基鍵合硅膠；流動(dòng)相為水-乙腈；運(yùn)行時(shí)間30min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30℃；按人參皂苷Rg1，Re，Rb1分別計(jì)算理論塔板數(shù)＞4 000，分離度＞1.5。

2.2.2 人參皂苷Rg1，Re，Rb1對(duì)照品溶液的配制

稱(chēng)取人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re對(duì)照品各10 mg，分別精密稱(chēng)定為0.010 3，0.010 1，0.010 4 g，各置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，充分搖勻，制得人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密移取參山固體飲料部分藥材的醇提各樣品液適量，過(guò)0.22μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，即制得部分藥材醇提供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備

按處方比例稱(chēng)取除去人參的其他藥材，依照醇提液的制備工藝和供試品溶液的處理方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.5 人參皂苷Rg1，Re，Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備及線(xiàn)性范圍

取1.03 mg/mL的人參皂苷Rg1，1.01 mg/mL的人參皂苷Rb1，1.04 mg/mL的人參皂苷Re對(duì)照品溶液分別依次稀釋成 100，90，80，70，60，50，40，30，20，10μg/mL的質(zhì)量濃度，按2.2.1項(xiàng)下色譜分離條件進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，分別以人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度、人參皂苷Re質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明，人參皂苷Rg1線(xiàn)性回歸方程為Y=0.802 8X+0.146 3，R2=0.999 4；人參皂苷Rb1線(xiàn)性回歸方程為Y=0.795 4X+0.276 3，R2=0.999 7；人參皂苷Re線(xiàn)性回歸方程為Y=0.387 1X+0.159 3，R2=0.999 2，即人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在10～100μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.6 分離條件的考查

精密吸取對(duì)照品溶液10μL，供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果可知，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有一相同的色譜峰，而陰性對(duì)照液未見(jiàn)干擾。

對(duì)照品（由左到右依次為人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1）見(jiàn)圖1，參山固體飲料部分中藥醇提樣品供試液見(jiàn)圖2，陰性對(duì)照品溶液見(jiàn)圖3。

圖1 對(duì)照品（由左到右依次為人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1）

圖2 參山固體飲料部分中藥醇提樣品供試液

圖3 陰性對(duì)照品溶液

2.2.7 方法學(xué)考查

人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re的儀器精密度RSD分別為1.012%，1.089%，1.062%；供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，測(cè)定應(yīng)在48 h內(nèi)完成；重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為1.871%，1.764%，1.683%；加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，參山固體飲料部分藥材的醇提樣品液中人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re平均回收率分別為100.2%，100.6%，98.87%；RSD分別為0.86%，0.62%，0.66%。

參山固體飲料部分中藥醇提次數(shù)的考查見(jiàn)表1，參山固體飲料部分中藥醇提正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)見(jiàn)表3。

2.3 參山固體飲料醇提工藝條件研究

2.3.1 參山固體飲料部分中藥醇提基本方法

將人參、桑葚、玫瑰花，加一定濃度一定藥材倍量的乙醇，浸泡一定時(shí)間，回流一定時(shí)間，同法回流2次或3次，過(guò)濾合并濾液，濃縮并定容至一定體積。

表1 參山固體飲料部分中藥醇提次數(shù)的考查

表2 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表3 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.3.2 參山固體飲料部分中藥醇提次數(shù)的考查

取人參、桑葚、玫瑰花3份，每份100 g，按表1設(shè)計(jì)方案中的參數(shù)分別回流法醇提，制備3份醇提液，于50℃下減壓濃縮并定容至100 mL，按2.2.3分別處理成供試液，每份按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定3種人參皂苷含量。

參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素間方差分析見(jiàn)表4。

表4 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素間方差分析

由表4可知，醇提2次3種人參皂苷之和提取量占醇提3次的95%以上，故醇提2次為佳。

2.3.3 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、加醇量（倍）、醇提時(shí)間（h）、浸泡時(shí)間為考查因素，以3種人參皂苷之和百分比（%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)值，選用四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)法進(jìn)行醇回流提取2次，考查各因素不同水平對(duì)3種人參皂苷含量的影響，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差和方差分析，篩選最優(yōu)醇提工藝參數(shù)，由于以人參皂苷含量為主要指標(biāo)，參考文獻(xiàn)[8]中對(duì)人參皂苷的提取因素及水平，設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)水平間方差分析見(jiàn)表5。

表5 參山固體飲料部分中藥醇提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)水平間方差分析

由極差R值可知，4個(gè)因素對(duì)參山固體飲料醇提液中3種人參皂苷含量影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A） ＞ 加醇量 （B） ＞ 浸泡時(shí)間 （D） ＞ 醇提時(shí)間（C）；A因素及水平（除2水平與3水平外） 皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B因素1水平與3水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C因素和D因素及水平間皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從表7，表8和經(jīng)濟(jì)成本角度考慮，參山固體飲料醇提最佳提取工藝條件為A1B1C1D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，浸泡 1 h，加醇量為生藥量的12倍和8倍，醇回流提取1.5 h和1.0 h，由于該醇提條件系第1列試驗(yàn)號(hào)，所以不必驗(yàn)證。

2.4 茯苓、枸杞子、山藥與醇提藥渣一并水提工藝條件研究

2.4.1 參山固體飲料中藥水提基本方法

將茯苓、枸杞子、山藥加一定量水浸泡2 h，加入醇提藥渣一并水提回流2次或3次，每次水提回流一定時(shí)間，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至一定體積。

2.4.2 參山固體飲料中藥復(fù)方水提次數(shù)考查

取茯苓、枸杞子、山藥3份，每份100 g，分別浸泡，加入醇提藥渣，按表6設(shè)計(jì)方案中的參數(shù)分別水提，制備3份水提液，于50℃下減壓濃縮至100 mL，按2.1.2分別處理成供試液，每份按2.1項(xiàng)下測(cè)定多糖含量。

參山固體飲料中藥復(fù)方水提次數(shù)考查設(shè)計(jì)見(jiàn)表6。

表6 參山固體飲料中藥復(fù)方水提次數(shù)考查設(shè)計(jì)

由表6可知，水提2次多糖提取量占水提3次的94%以上，故水提2次為佳。

2.4.3 參山固體飲料中藥復(fù)方水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果分析

選取水提溫度（℃）、加水量（倍）、水提時(shí)間（h） 為考查因素，以多糖含量（%） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)值，選用三因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)法進(jìn)行水回流提取2次，考查各因素不同水平對(duì)多糖含量的影響，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差和方差分析，篩選最優(yōu)水提工藝參數(shù)。

茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表7，茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提正交試驗(yàn)見(jiàn)表8，茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提方差分析見(jiàn)表9。

表7 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提因素與水平設(shè)計(jì)

表8 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提正交試驗(yàn)

表9 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提方差分析

由極差R'值可知，3個(gè)因素對(duì)茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提藥液中多糖含量的影響順序?yàn)樗釡囟龋ˋ'）＞水提時(shí)間（C'）＞加水量（B'）；A'、B'、C'三因素及水平間皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度考慮，茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提最佳工藝條件為A'3B'1C'1，即水提溫度100℃，加水量為生藥量的15倍和10倍，水提時(shí)間1.5 h和1.0 h。

2.4.4 茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣一并水提工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

取茯苓、枸杞、山藥與醇提藥渣（人參、桑葚、玫瑰花）混合，按水提最優(yōu)工藝參數(shù)為水提2次，水提溫度100℃，浸泡2.0 h，加水量為生藥量的15倍的10倍，水提時(shí)間1.5 h和1.0 h，平行試驗(yàn)3次。

水提驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 水提驗(yàn)證結(jié)果

由表10可知，多糖含量高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排表中的任何一列數(shù)據(jù)，表明水提工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行，可重復(fù)。

3 結(jié)論

（1）參山固體飲料由藥材和食材組成，中藥復(fù)方提取液濃縮后再?lài)婌F干燥成粉和菌湯噴霧干燥所得粉按比例混和，組方和工藝均兼顧口感和功效，是典型的具有中醫(yī)藥膳特色的現(xiàn)代產(chǎn)品劑型，對(duì)藥材提取這部分工藝及參數(shù)進(jìn)行了試驗(yàn)研究，為后續(xù)部分的噴霧干燥制成中藥干浸膏粉和菌湯粉工藝研究奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)，具有實(shí)用意義和應(yīng)用價(jià)值。

（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)、加醇量、浸提時(shí)間對(duì)藥材中人參皂苷的提取量影響顯著。從理論上講提取次數(shù)越多越好，提取次數(shù)太多，時(shí)間周期長(zhǎng)，效率低，溶劑量多也給濃縮帶來(lái)不便。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)研究，得出最優(yōu)醇提工藝參數(shù)為醇提2次，浸泡時(shí)間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，加乙醇量為藥材量的12倍和8倍，醇回流時(shí)間1.5 h和1.0 h；最優(yōu)水提工藝參數(shù)為水提2次，浸泡時(shí)間2 h，水提溫度100℃，加水量為藥材量的15倍和10倍，水提時(shí)間1.5 h和1.0 h。

（3）采用醇提方法主要提取人參、桑葚、玫瑰花中的人參皂苷，水提方法主要提取茯苓、枸杞、山藥多糖，成本較低、操作簡(jiǎn)便、提取條件易于控制、且提取效率較高，在工業(yè)化大生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

（4） 采用苯酚-硫酸法測(cè)定水提液中多糖的含量誤差較大，是導(dǎo)致正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)意義的主要原因，應(yīng)增加多糖測(cè)定的重復(fù)次數(shù)，以重復(fù)試驗(yàn)的誤差作為誤差來(lái)源，另外參考課題組的其他多糖提取正交試驗(yàn)推測(cè)多糖在提取溫度85℃時(shí)即可充分提取，在100℃提取溫度下提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)破壞多糖活性，故也可能導(dǎo)致各因素水平差異不顯著。