袁 河，肖曉義，康志嬌，夏延斌，趙志友，江日初

（1.湖南省檳榔加工與食用安全工程技術研究中心，湖南賓之郎食品科技有限公司，湖南湘潭 411100；2.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙 410128；3.湘潭市食品藥品監(jiān)督管理局，湖南湘潭 411100）

檳榔為棕櫚科植物檳榔（Areca catechuL.）的干燥成熟種子，廣泛栽培于中國、印度、印度尼西亞、斯里蘭卡、菲律賓等南亞及東南亞國家[1]。檳榔是四大南藥之首，藥理研究表明檳榔具有驅(qū)蟲滅螺、抑菌、促胃腸道消化運動、誘發(fā)口腔黏膜纖維化病變和心血管病變等生理效應[2-3]。引起這種生理效應的關鍵物質(zhì)就是檳榔堿[4-5]，它是檳榔的有效成分，也是檳榔化學物質(zhì)成分中含量最多的生物堿，其含量達到0.30%～0.63%[6]。各種研究表明，只有當檳榔堿含量達到一定濃度以后才會產(chǎn)生各種生理效應，因此準確無誤地測量檳榔中檳榔堿的含量對后續(xù)病理學研究具有十分重要的意義。

采用了高效液相色譜法測定檳榔中檳榔堿的含量，再依據(jù)JJF 1059.1—2012測量不確定度評定與表示，對測量海南原果中檳榔堿的過程中產(chǎn)生的不確定度進行了分析評定。充分驗證了分析方法的可行性和合理性，同時確保了試驗結(jié)果的準確性和有效性，為使用高效液相色譜法測定中藥有效成分含量的不確定度研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

檳榔，海南新鮮原果。

氫溴酸檳榔堿標準品（純度為99.8%），中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純），美國TEDIA公司提供；磷酸、三乙胺（色譜純），國藥集團化學試劑有限公司提供；十二烷基磺酸鈉（分析純），上海麥克林生化科技有限公司提供。

1260 Infinity型配UV檢測器，美國安捷倫產(chǎn)品；KQ-700E型超聲波清洗機，昆山美美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；十萬分之一分析天平、百分之一天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試樣制備與測定

（1）將海南檳榔鮮果切開后放入干燥箱中于60℃下恒溫干燥至恒質(zhì)量，用粉碎機粉碎后，密封干燥備用。

（2） 準確稱取檳榔試樣1.0 g（精確到0.01 g），置于50 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL水，超聲提取30 min，冷卻至室溫后，取上層清液用0.45μm濾膜過濾，濾液用于液相色譜儀分析。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取氫溴酸檳榔堿標準品13.89 mg于100 mL容量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.138 9 mg/mL的氫溴酸檳榔堿標準儲備液。

1.4 標準溶液工作曲線的繪制

準確移取0.138 9 mg/mL的氫溴酸檳榔堿標準儲備液 1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中并加蒸餾水定容至刻度。得到標準溶液系列質(zhì)量濃度分別為 13.9，27.8，55.6，83.3，111.1，138.9μg/mL。與樣品溶液同時用高效液相色譜儀分析測定其峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，用最小二乘法擬合得標準曲線方程Y=a X+b（a為斜率，b為截距）與相關系數(shù)。

1.5 色譜條件

高效液相色譜條件為：色譜柱Hypersil BDSC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進樣量10μL；檢測波長215 nm；流動相：以水溶液（1 L水加入磷酸1.0 mL，十二烷基磺酸鈉10 g，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3） 為流動相A，以甲醇為流動相B。按流動相A∶流動相B=52∶48進行等度洗脫。

2 數(shù)學模型的建立

式中：X——試樣中檳榔堿含量，g/kg；

C——由標準曲線得出的樣液中待測組分的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——試樣提取液總體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g；

1 000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。

計算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

3 不確定度分量的主要來源

檳榔中檳榔堿含量測定的不確定度主要來自于標準儲備液、標準曲線的擬合、樣品的定容、樣品稱量、樣品測量重復性及提取過程對樣品回收率的影響。

4 不確定度的評估

4.1 標準儲備液引入的相對標準不確定度u rel（c）

標準儲備液引入的不確定度主要包括標準物質(zhì)純度、標準物質(zhì)的稱量及標準物質(zhì)的定容。

4.1.1 標準物質(zhì)純度引入的不確定度u（p）

氫溴酸檳榔堿標準物質(zhì)證書給出其純度為p=99.8%，假設其為矩形分布，包含因子km=，則其相對標準不確定度為：

4.1.2 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度u（m）

分析天平證書實際分度值d=0.01mg，區(qū)間半寬度αm=0.005 mg，假設其為矩形分布，包含因子km=，則其標準不確定度為：

稱取氫溴酸檳榔堿標準物質(zhì)的質(zhì)量為13.89mg，則稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

4.1.3 標準物質(zhì)的定容引入的不確定度u（V）

（2）溫度引入的不確定度。容量瓶的校準溫度為20℃，實驗室溫度在20±5℃變化。液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮液體的體積膨脹。因此容量瓶溶液溫度與校準時溫度不同所引起的體積變化為100 mL×5℃×2.08×10-4℃-1=0.104 mL（2.08×10-4℃-1為水的膨脹系數(shù)），假設其為矩形分布，則溫度對定容體積影響所引入的不確定度為：

因此定容體積引入的相對標準不確定度為：

由此得出標準儲備液引入的相對標準不確定度為：

4.2 標準曲線的擬合引入的相對標準不確定度u rel（g）

標準曲線引入的不確定度包括定容容器和標準曲線的擬合。

4.2.1 配制標準溶液所用的容器引入的不確定度urel（b）

分別用2.0，5.0，10.0 mL分度移液管從標準溶液中分別準確移取1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL溶液置于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度。

根據(jù)中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程JJG 196—2006，假設其為矩形分布。

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量器校準引入的不確定度見表1。

表1 量器校準引入的不確定度

因此容器引入的相對標準不確定度為：

4.2.2 標準曲線擬合引入的不確定度u（q）

試驗對6個不同質(zhì)量濃度標準工作液進行測定，記錄所得峰面積與對應濃度。

標準曲線原始記錄見表2。

表2 標準曲線原始記錄

采用最小二乘法對氫溴酸檳榔堿的濃度與其對應的平均峰面積進行線性回歸，得到氫溴酸檳榔堿標準曲線：Y=21.84X-3.34，R2=0.999 97。

對待測試樣進行了6次測量，由標準曲線方程求得待測液中氫溴酸檳榔堿的質(zhì)量濃度C氫溴酸檳榔堿，則C氫溴酸檳榔堿的標準不確定度為：

C氫溴酸檳榔堿的相對標準不確定度為：

由最小二乘法擬合曲線求得c氫溴酸檳榔堿時所產(chǎn)生的標準不確定度u（q）和相對標準不確定度urel（q）。

標準曲線不確定度結(jié)果見表3。

表3 標準曲線不確定度結(jié)果

由此得出標準曲線擬合引入的相對不確定度為：

4.3 樣品定容引入的相對標準不確定度u rel（d）

（1）量筒引入的不確定度。由校準證書給出的100 mL量筒（A級） 的不確定度為0.2 mL，假設其為矩形分布，則100 mL量筒引入的不確定度為：

（2）溫度引入的不確定度。量筒溶液溫度與校準時溫度不同所引起的體積變化為100 mL＞5℃×2.08×10-4℃-1=0.104 mL（2.08×10-4℃-1為水的膨脹系數(shù)），假設其為矩形分布，則溫度對體積影響所引入的不確定度為：

因此樣品定容引入的相對標準不確定度為：

4.4 樣品稱量引入的相對標準不確定度u rel（z）

稱取檳榔樣品1.00 g，校準證書給出分析天平允差為0.005 g，假設其為矩形分布，故由天平在樣品稱量時引入的不確定度為：

4.5 樣品測量重復性引入的相對標準不確定度u rel（e）

分別稱取6份同一檳榔樣品1.00 g，測得樣品中氫溴酸檳榔堿的含量，假設其為矩形分布。

樣品6次平行測定結(jié)果見表4。

表4 樣品6次平行測定結(jié)果

由表4得出，測量重復性引入的相對標準不確定度為：

4.6 提取過程對樣品回收率的影響所引入的相對標準不確定度u rel（C Rec）

樣品提取過程的回收率經(jīng)對該樣品所測的物質(zhì)進行9次回收試驗，得平均回收率為102.3%，其標準偏差4.21%。其標準不確定度采用平均標準偏差，其回收率的相對不確定度為：

提取過程回收率結(jié)果分析見表5。

表5 提取過程回收率結(jié)果分析

4.7 合成標準不確定度

上述各分量相對不確定度合成檳榔堿含量的相對標準不確定度為：

4.8 擴展不確定度

相對擴展不確定度在95%，置信水平下取包含因子k=2，得相對擴展不確定度為：

檳榔樣品中檳榔堿含量為3.31g/kg，得擴展不確定度為：

綜上可得，檳榔樣品中檳榔堿含量不確定度為：3.31±0.052 g/kg（k=2）。

5 結(jié)論

檳榔中檳榔堿的測定的不確定度來源主要為標準儲備液、標準曲線的擬合、樣品的定容、樣品稱量、樣品測量重復性及提取過程對樣品回收率的影響。從不確定度的評定結(jié)果來看，標準曲線的擬合和樣品測量重復性引入的不確定度最大，可以通過以下途徑降低測定結(jié)果的不確定度：

①增強試驗人員的技術能力，提高其操作穩(wěn)定性；②多維護保養(yǎng)儀器，盡量提高儀器的精密度；③盡量保持試驗溫度的穩(wěn)定性，減少隨機誤差。