楊 靜，程宇琪，姜紅燕，羅雄劍，陳嫻瑜，沈宗霖，周 聰，許秀峰*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明650000；2.中國科學(xué)院大學(xué)昆明動(dòng)物所，云南 昆明650000*通信作者：許秀峰，E-mail：xfxu2004@sina.com）

近年來，家系、雙胞胎和寄養(yǎng)研究表明，精神分裂癥具有很強(qiáng)的遺傳傾向，其遺傳度高達(dá)80%～85%［1］。目前精神分裂癥病因?qū)W研究尚未得出一致結(jié)論，神經(jīng)發(fā)育障礙是最主要的機(jī)制，影響因素包括遺傳、表觀遺傳以及后天環(huán)境等。遺傳流行病學(xué)研究顯示，遺傳因素對(duì)精神分裂癥的發(fā)生影響較大［2-3］。隨著新型遺傳標(biāo)記的出現(xiàn)，病例-對(duì)照相關(guān)分析被大量應(yīng)用于甄別精神分裂癥的易感基因，主要利用單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Single nucleotide polymorphism，SNP）作為遺傳標(biāo)記，其分辨率可以達(dá)到一個(gè)堿基，可以進(jìn)行較為精準(zhǔn)的易感基因定位。近年來，隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，疾病的易感基因發(fā)現(xiàn)與定位有了可能，大量的精神分裂癥全基因組關(guān)聯(lián)分析研究已經(jīng)甄別到了許多達(dá)到基因組范圍內(nèi)顯著相關(guān)的位點(diǎn)和基因，包括MHC、MIR137、TCF4、CACNA1C、GRM3、GRIA1、ZNF804A、VRK2、ITIH3/4、NDST3、NOTCH4和BCL9等［4-9］。本研究結(jié)合近年來精神分裂癥相關(guān)熱點(diǎn)基因陽性結(jié)果，選擇代謝型谷氨酸受體3基因（GRM3）、AMPA受 體1基因（GRIA1）和轉(zhuǎn)錄因子4基因（TCF4）部分多態(tài)性位點(diǎn)，從分子水平上探索遺傳學(xué)因素與精神分裂癥的關(guān)系，為精神分裂癥的遺傳學(xué)研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

于2011年9月-2013年12月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科選取精神分裂癥患者為病例組。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)（第4版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-IV）精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩名精神科副主任醫(yī)師職稱及以上的醫(yī)師做出一致診斷；②年齡12～48歲；③患者本人或其法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神發(fā)育遲滯；②有腦器質(zhì)性疾病、頭部外傷史、癲癇發(fā)作史；③當(dāng)前或既往有物質(zhì)濫用史；④既往患有嚴(yán)重軀體疾病，如神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管、肝、腎、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病等。符合入組標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)共663例，其中男性296例，女性367例，年齡（30.9±11.2）歲。于2016年9月-11月在昆明市第一人民醫(yī)院體檢中心選取健康人為對(duì)照組。入組標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)前或既往無精神障礙史；②年齡12～48歲；③均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神發(fā)育遲滯；②患有腦器質(zhì)性疾病、有頭部外傷史、癲癇發(fā)作史；③當(dāng)前或既往有物質(zhì)濫用史；④既往患有嚴(yán)重軀體疾病，如神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管、肝、腎、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病等；⑤精神病家族史陽性者。符合入組標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)共690例。其中男性414例，女性276例，年齡（35.9±12.7）歲。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用酚/氯仿法提取基因組DNA，DNA樣本成品放置于-80℃冰箱中備用。利用primer 5.0進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，采用SNaPshot基因分型技術(shù)對(duì)12個(gè)SNPs進(jìn)行基因型檢測(cè)，12個(gè)SNPs的選擇主要基于以下標(biāo)準(zhǔn)：①主要選擇以前研究中最顯著的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)很可能包含致病位點(diǎn)或與致病突變緊密相連，如rs9636107和rs12704290與精神分裂癥相關(guān)；②考慮所選SNP是否有潛在的功能，如rs1428920和rs2926835位于GRIA1的內(nèi)含子中，可能會(huì)影響GRIA1的表達(dá)，rs274622和rs12966547位于GRM3和TCF4啟動(dòng)子附近，因而也有可能會(huì)影響GRM3和TCF4表達(dá)；③通過Ensemble數(shù)據(jù)庫（http：//www.ensemble.org）確定上述位點(diǎn)在中國漢族人群中的最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）＞0.05。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用Plink 1.07對(duì)所選SNP進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）及相關(guān)分析；運(yùn)用Haploview 4.2對(duì)同一基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析；單倍型分析使用SHEsis在線分析軟件（http：//analysis.bio-x.cn）；運(yùn)用在線軟件（http：//www.genemania.org/）［10］分析GRIA1、GRM3、TCF4之間是否存在功能聯(lián)系；運(yùn)用Quanto 1.2.4對(duì)樣本的統(tǒng)計(jì)效能進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組等位基因頻率

病例組GRM3多態(tài)性位點(diǎn)rs6465084的A等位基因頻率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）。見表1。

表1 兩組等位基因頻率

續(xù)表1:

2.2 等位基因頻率和性別特異性相關(guān)分析

性別特異性相關(guān)分析結(jié)果表明，多態(tài)性位點(diǎn)rs6465084在男性中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）。見表2。

表2 等位基因頻率和性別特異性相關(guān)分析

續(xù)表2:

續(xù)表2:

2.3 連鎖不平衡分析結(jié)果

連鎖不平衡分析顯示，多態(tài)性位點(diǎn)rs6465084和rs12704290高度連鎖不平衡（D’=0.88）。見圖1。

2.4 GRM3基因相關(guān)位點(diǎn)的單倍型頻率

本研究對(duì)兩位點(diǎn)構(gòu)建了3種單倍型，其中A-G（P=0.004，OR=1.357）與G-G（P=0.018，OR=0.754）在病例組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

圖1 GRM3基因上多態(tài)性位點(diǎn)間連鎖不平衡分析結(jié)果

表3 GRM3基因相關(guān)位點(diǎn)的單倍型頻率

3 討 論

在本研究中，除了rs2958182位點(diǎn)在對(duì)照中不符合HWE，其余所有位點(diǎn)在病例對(duì)照中均符合HWE。本研究通過測(cè)序證實(shí)rs2958182位點(diǎn)基因分型的正確性，因此排除了其不符合HWE并不是由于基因分型誤差造成的。與對(duì)照組相比，GRM3 rs6465084位點(diǎn)在精神分裂癥患者中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027），Chang等［11］對(duì)中國漢族人群（包括1115例精神分裂癥患者和2289例健康對(duì)照者）的研究顯示，rs6465084位點(diǎn)與精神分裂癥相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。由于rs6465084位點(diǎn)位于GRM3內(nèi)含子上，該位點(diǎn)的變異不會(huì)造成谷氨酸受體的結(jié)構(gòu)和功能改變，但內(nèi)含子的變異可能會(huì)調(diào)控基因表達(dá)，因此該位點(diǎn)的變異可能導(dǎo)致GRM3轉(zhuǎn)錄時(shí)的改變，使得GRM3表達(dá)異常，谷氨酸受體與游離谷氨酸結(jié)合力下降，降低腦內(nèi)谷氨酸水平，增加精神分裂癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

GRM3存在于人類染色體7q21.1，長度約為220 kb，主要與學(xué)習(xí)記憶中的突觸傳遞、可塑性改變、神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)等生理過程以及腦缺血、神經(jīng)元變性疾病等病理過程密切相關(guān)。GRM3主要存在于大腦背外側(cè)前額葉皮層（PFC）的椎體細(xì)胞層內(nèi)，N-乙酰天冬氨酸（N-acetylaspartat，NAA）是GRM3的激動(dòng)劑，正常情況下，NAA通過抑制突觸后cAMP-K+通道來增強(qiáng)突觸的連接性，從而增加細(xì)胞的放電頻率，維持正常的工作記憶，因此，PFC受損會(huì)影響cAMP信號(hào)通路的傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞放電頻率降低，進(jìn)而影響工作記憶，產(chǎn)生認(rèn)知功能缺陷［12］。Egan等［13］研究表明，rs6465084位點(diǎn)與精神分裂癥相關(guān)（P=0.02），A/A基因型個(gè)體右背外側(cè)前額葉皮層NAA水平和語言流暢性均低于G等位基因攜帶者，A等位基因攜帶者的學(xué)習(xí)、記憶能力較低。A/A基因型個(gè)體的前額葉皮層的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（excitatory amino acid transporter 2，EAAT2）的mRNA水平較低。膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主要功能是清除突觸間隙的谷氨酸，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的GRM3通過增加EAAT2受體的表達(dá)，從而增加谷氨酸的攝取，使細(xì)胞內(nèi)外的谷氨酸水平達(dá)到穩(wěn)態(tài)［14-15］。Kerdsan等［16］研究表明，rs6465084位點(diǎn)的變異與EAAT2的水平無關(guān)。Xia等［17］的研究與Egan等的研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)rs6465084位點(diǎn)A/A基因型個(gè)體的右背外側(cè)前額葉皮層NAA水平比G等位基因攜帶者的NAA水平低。M?ssner等［18］研究顯示，A/A基因型患者的決策能力以及對(duì)數(shù)字、符號(hào)等的測(cè)試成績更差。以上結(jié)果均證實(shí)rs6465084位點(diǎn)的等位基因A是導(dǎo)致精神分裂癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，其機(jī)制可能是通過影響GRM3的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程從而降低大腦背外側(cè)前額葉皮層的EAAT2水平，使得突觸間隙谷氨酸水平升高、細(xì)胞內(nèi)外的谷氨酸水平失衡，導(dǎo)致谷氨酸受體與谷氨酸的結(jié)合率下降，中樞谷氨酸水平下降，從而影響認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等過程，產(chǎn)生一系列精神病性癥狀，增加精神分裂癥的易感性。

本研究亦發(fā)現(xiàn)GRM3 rs6465084位點(diǎn)對(duì)精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制與性別相關(guān)，男性更易發(fā)病。有研究報(bào)道COMT對(duì)精神分裂癥的影響與性別相關(guān)，且Reelin rs7341475位點(diǎn)的突變?cè)谂灾信c精神分裂癥顯著相關(guān)［19-20］，該結(jié)果與本研究結(jié)果相反。動(dòng)物學(xué)研究顯示，NRG1是精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)因素，可以使小鼠內(nèi)表型發(fā)生突變，并且與性別相關(guān)，雄性精神分裂癥模型小鼠主要表現(xiàn)為記憶和情緒的缺陷，而雌性精神分裂癥模型小鼠并無任何缺陷［21］。

本研究中，多態(tài)性位點(diǎn)rs6465084與rs12704290呈高度連鎖不平衡，但rs12704290位點(diǎn)與精神分裂癥無關(guān)聯(lián)，rs12704290位點(diǎn)的OR值為1.265，其G等位基因攜帶者仍有一定的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，符合兩位點(diǎn)連鎖不平衡的遺傳特征。

本研究局限性在于：①由于地域、種族的差異以及精神分裂癥的遺傳異質(zhì)性較高，本研究中的其余位點(diǎn)尚未能在云南地區(qū)人群中重復(fù)驗(yàn)證；②本研究樣本量較小，以致造成諸多局限，未來有必要在更大樣本中驗(yàn)證這種相關(guān)性并了解其分子機(jī)制。