陳冰

基因編輯可靠嗎？基因治療安全嗎？眼下還沒有人能夠給出確定的答案。畢竟這一前沿技術一直面臨著倫理和技術的雙重拷問，世界各國一直都在審慎對待。

撇開可能存在的大量倫理困境，就基因編輯技術本身而言，脫靶效應是基因編輯技術最大的風險來源，然而之前從來沒有人能非常精確地測定脫靶效應。如今，來自中國科學院神經科學研究所（中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心）、上海腦科學與類腦研究中心的一群科學家們發(fā)明了一套精確靈敏的檢測方法，從而可以客觀、可靠地評估基因編輯工具的脫靶率。3月1日，國際頂尖學術期刊《科學》刊登論文，報道了中國科學家建立的新型脫靶檢測技術“GOTI”，這項被多位審稿人贊嘆為“精美”的新成果，將基因編輯技術脫靶檢測的敏感性大大提升，為基因編輯的安全性評估帶來了新突破。

這項顛覆以往檢測手段的基因編輯脫靶檢測技術，令人震驚地首次證實，被認為“特別安全、幾乎不會有脫靶”的單堿基編輯技術，可能導致大量無法預測的脫靶，存在嚴重的安全風險。這一重大發(fā)現(xiàn)為近年來興起單堿基基因編輯技術踩下了剎車——數家美國公司停下了臨床應用的腳步，人們再次意識到，我們必須更加謹慎地對待基因編輯這項新技術，開發(fā)出更安全的基因編輯工具。

畢竟，基因編輯的潘多拉魔盒一旦打開，將會是全人類不能承受之重。

基因治療是福還是禍？

2月最后一天，國際罕見病日。

全世界有超過7000種罕見病，病患人數超過3億人，其中80%是單基因遺傳病。20000多個基因里，只要有一個基因發(fā)生突變，就有可能出現(xiàn)先天性失明、耳聾等罕見病癥狀。罕見病有50%發(fā)生在兒童時期，因而其早期診斷對于迅速有效的干預至關重要。經過長期研究發(fā)現(xiàn)，如果利用安全、有效的基因編輯技術，對發(fā)生突變的單個堿基進行剪斷、加入或替換等修正操作，可以改寫基因組遺傳密碼中，能明確遺傳性疾病的發(fā)病機制，從而推進罕見病的診治。目前全球95%的罕見病并沒有有效的治療藥物，而預計到2022年，在基因編輯技術的支撐下，全球將有超過40種基因治療新藥上市。這意味著，也許只需使用基因編輯技術，改變幾個堿基，就能挽救一些孩子的生命，還他們以健康。這看上去簡直太令人興奮了。

《科學》3月1日在線發(fā)表GOTI新型脫靶檢測技術研究論文。

從上世紀80年代科學家提出“基因治療”理論至今，全世界僅有兩三種基因編輯技術走到了臨床試驗階段。將其擋在醫(yī)院之外的重要原因，就是人們無法明確驗證現(xiàn)有基因編輯技術的安全性。1999年，美國一位18歲患者在接受基因治療后意外死亡，導致基因治療臨床研究進入十年“寒冬”。

直到2012年，使用cas9蛋白酶和sgRNA組合物對基因進行精確修改的新一代基因編輯工具CRISPR/Cas9被發(fā)明出來，基因編輯的技術門檻大大降低，在生命科學和醫(yī)學領域激起狂喜與熱潮。

使用CRISPR/Cas9技術，會導致雙鏈螺旋結構的DNA發(fā)生斷裂，從而可能導致染色體丟失、異位，容易發(fā)生癌癥。于是，在CRISPR/Cas9技術基礎上衍生出了第四代單堿基基因編輯技術BE3，成了新的熱點?！叭绻袰RISPR比作一輛車，它到了目的地，原來的Cas9需要切斷DNA，BE3則是對堿基進行修改，不會產生斷裂?！?中國科學院神經科學研究所靈長類疾病模型研究組組長、研究員楊輝這樣解釋兩者差異。

看上去是不是更美好了？

業(yè)界也普遍認為基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術將為人類的健康做出巨大貢獻。特別是衍生技術BE3，在之前的研究中從未發(fā)現(xiàn)過有明顯的脫靶問題。然而每一次基因編輯操作本質上都是成千上萬的基因編輯工具分子對著成千上萬的細胞做了成千上萬次編輯，怎么可能每次都萬無一失呢？

人類的DNA共有超過30億個堿基，其中1.1%是基因片段，其他雖然不參與基因編碼，卻也同樣承載我們的生命活動信息。基因編輯產生的脫靶效應會帶來大量突變，這些突變涉及了基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，甚至有可能會直接影響機體的生理功能，簡單來說就是我們本來把它設計成編輯A基因，但它卻意外搞壞了B基因。

本來大家都盼望著基因編輯技術可以挽救一些目前無法治愈的遺傳病，現(xiàn)在倒好，說不定應該修復的致病基因沒有搞定，卻意外搞壞了某個阻止癌癥的基因，那豈不是治病不成反要命？

“一般情況下基因編輯技術，是利用病毒為載體，將一把把‘小剪刀運輸到細胞內。如果‘小剪刀準確到達了設定的目標區(qū)域作了修改，我們很容易知道。但那些落在其他區(qū)域的‘小剪刀誤打誤撞帶來了哪些差異，卻很難察覺?！睏钶x解釋說，基因編輯中的“脫靶”，就像射偏了的箭頭，可能會改變其他正常的基因，意味著對生命運行的巨大安全隱患，很難讓人安心使用。

檢測結果的出現(xiàn)并不意味著對基因編輯技術判了“死刑”。很多人的遺傳病是單堿基突變導致的，所以單堿基突變這個技術本身還有著巨大的價值。

檢測脫靶，難在哪里？

要解決脫靶問題，首先是要確定基因編輯工具的脫靶率，從而采用更不易脫靶的工具。然而尷尬的是，因為缺少檢測手段，科學家甚至根本就不知道基因編輯工具造成的脫靶問題有多嚴重，更別提比較幾種基因編輯工具的脫靶率了。

做一下對照能不能解決這個問題？傳統(tǒng)研究中，人們通常會試圖將樣本（比如說進行基因編輯的小鼠受精卵）分成兩份，一份做基因編輯，一份不做，最后再測定兩組小鼠的基因序列，除掉目標基因的變化，理論上剩下的基因差異就都有可能是基因編輯脫靶導致的。

然而理想很豐滿，現(xiàn)實卻很骨感。

首先世界上沒有任何兩只基因一模一樣的小鼠，你永遠不知道檢測出來的基因差異是源自基因編輯的脫靶還是兩組小鼠原本就有的個體差異。

第二，檢測基因序列需要大量的樣本，而傳統(tǒng)上獲得大量基因序列樣本的方法，就是將這些DNA樣本體外擴增。通俗來說就是把這些DNA樣本在體外復制成千上萬份，使之能滿足大量基因測序所需的量。然而即便是目前人類發(fā)明的最優(yōu)質的體外擴增體系也無法100%準確地擴增DNA，在擴增的過程會在DNA樣本中摻入大量的突變，最終讓DNA樣本面目全非，這就是所謂的“擴增噪音”。

同樣，你也無法判斷你檢測出來的DNA序列差異究竟來自脫靶效應的結果還是擴增噪音。

更糟糕的是，基因編輯脫靶本身就是極其小概率的事件。這種信號很容易淹沒在個體差異與擴增噪音之中，就像你無法在傾盆大雨中辨認出某一滴水滴落的響聲一樣。

在此之前，科學家們推出的多種檢測脫靶的辦法并不理想，比如計算機軟件預測、高通量測序檢測，甚至還有體外檢測，它們都有一些局限性，尤其是對單堿基突變無能為力。

2017年的一天，因為不同意一篇科學論文得出的“CRISPR/Cas9技術存在大范圍脫靶現(xiàn)象”結論，中科院神經科學研究所最年輕的研究組長楊輝研究員和博士后左二偉關在實驗室里討論了一個多小時，忽然意識到，可以換一個思路：檢測一個基因編輯過的細胞中所有DNA序列，并與正常細胞進行比對，獲得更精準的脫靶率。

此后一年半時間里，如今已是中科院神經科學研究所（中科院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心）、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室、中國科學院靈長類神經生物學重點實驗室研究員的楊輝，與中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所隸屬的計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學伙伴研究所）李亦學研究組、斯坦福大學遺傳學系及中國農業(yè)科學院深圳農業(yè)基因組研究所的合作者們，一起將他們的想法落實，變成了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測手段的新型檢測技術。

楊輝研究組與合作者們在體積遠遠大于正常細胞的小鼠受精卵上做實驗，將剛分裂成兩個細胞的小鼠受精卵分出一個細胞進行基因編輯操作，并用紅色熒光蛋白進行標記;另一個保持不變。等它發(fā)育到14.5天時，利用紅色標記分選出編輯過和沒編輯過的細胞，分別進行全基因組測序。

由于實驗組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本可以被認為是基因編輯工具造成的，而避免了單細胞體外擴增帶來的噪音干擾。

這種“GOTI”脫靶檢測方法的新設計，被《科學》的幾位審稿人異口同聲地稱贊為“精美”。

意外發(fā)現(xiàn)

有了GOTI檢測系統(tǒng)，科學家們迫不及待地對目前熱門的幾種基因編輯工具試行檢測。如楊輝、左二偉等人所料，此前被報道會導致大量基因突變致癌的經典版CRISPR/Cas9技術，并沒有明顯的脫靶效應。這個結果，結束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的各種爭議。

楊輝研究員在顯微鏡下做基因編輯。

被人們寄予厚望的第四代單堿基基因編輯技術BE3，在此前研究中從未發(fā)現(xiàn)有明顯脫靶問題，在GOTI的檢測下卻出人意料地發(fā)現(xiàn)，存在非常嚴重的脫靶，脫靶數量是自然發(fā)生突變數量的20倍以上;而且這些脫靶隨機分布，不可預測。團隊分析后認為，BE3的脫靶位點有部分出現(xiàn)在抑癌基因上，因此其有著很大的隱患，目前不適合作為臨床技術。

美國的一家基因編輯公司原本已有利用該技術治療地中海貧血的醫(yī)療項目在申請臨床批件。楊輝的實驗結果一出，這一可能帶來嚴重后果的基因編輯臨床應用實驗即刻踩下了“剎車”。

楊輝感慨，“在此之前，單堿基突變技術一直被認為是一種特別安全，幾乎不會有脫靶的新技術，其實現(xiàn)在回過頭來看，我們發(fā)現(xiàn)從基礎的生物學理論上是可以推斷出這些技術很可能有脫靶問題的，但是當時大家都太理所當然覺得它們很安全，用傳統(tǒng)的方法也的確沒有發(fā)現(xiàn)脫靶的問題以后，就沒有人再去仔細分析一下這些技術是不是真的那么安全。我們認為我們的成果在一定程度上也讓業(yè)界可以冷靜一點，更謹慎地對待這些新技術?！?/p>

當然，檢測結果的出現(xiàn)并不意味著對基因編輯技術判了“死刑”。很多人的遺傳病是單堿基突變導致的，所以單堿基突變這個技術本身還有著巨大的價值。

“如果現(xiàn)有基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，暫緩投入應用，就能避免更大的問題和研發(fā)損失。我們可以重新審視，對一些技術加以改良，開發(fā)出精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業(yè)的新標準?！睏钶x說。

目前，這一脫靶檢測技術已經申請專利，檢測成本也并不昂貴。楊輝團隊將進一步檢測，探查基因編輯技術除了會導致異常的基因突變之外，是否還有其他問題，并在此基礎上嘗試建立一種不會脫靶、也沒有其它風險的單堿基編輯技術。

在中國科學院院士、神經所所長蒲慕明看來，為基因編輯領域建立安全性標準，突破了技術瓶頸，對整個領域的健康發(fā)展具有重要意義——通過在全基因組范圍內廣譜檢測，獲得基因編輯的準確脫靶率，CRISPR/Cas9及其衍生工具便打開了通向臨床應用的一道重要壁壘。與此同時，中國科學家的這項研究，很可能會打破國際壟斷，在新一代基因編輯工具開發(fā)中，和未來的行業(yè)新標準中，留下中國人的印記。