陳高峰，王亞楠，王 丹，毛志慧，黃芝瑛，文海若，*，王 雪，*

(1.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全性研究北京市重點實驗室，北京 100176；2.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

體內試驗能夠較好地模擬藥物在機體吸收、分布、代謝、排泄并產(chǎn)生毒性作用的全過程，是藥物臨床前研究用以評價潛在遺傳毒性的重要手段。2011年修訂的人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會議(The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)遺傳毒性試驗指導原則S2(R1)[1]在原有的標準試驗組合基礎上增加了第2種選擇，即提供了不進行體外哺乳動物細胞試驗而直接開展體內遺傳毒性試驗的可能，同時，建議在可行的條件下將多個終點的遺傳毒性研究整合至一般毒性研究中，以符合動物試驗“3R”原則。這無疑是對體內遺傳毒性檢測方法提出了更高的要求，而目前被采納的體內試驗方法主要檢測染色體結構變化和DNA損傷。因此，亟需開發(fā)快速、簡便和實用的體內基因突變試驗方法，以滿足受試物遺傳毒性評價的需求。近年建立的Pig-a基因突變試驗作為新的體內遺傳毒性檢測方法得到了快速發(fā)展，該方法快速簡便，使用普通動物即可開展試驗，因此具有良好的實用性。

1 Pig-a基因突變試驗原理

人的磷脂酰肌醇聚糖A類基因(phosphatidylinositol glycan class A gene)，簡稱PIG-A基因(嚙齒類動物同源基因為Pig-a基因)，于1999年被Iida等[2]從人類基因組中成功分離。PIG-A基因位于X染色體上，在人和不同動物物種間具有高度保守性。該基因的單一突變即可導致糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol，GPI)錨無法正常合成，GPI的一端為磷脂結構，其脂肪酸鏈位于細胞膜內，起連接固定作用；另一端為異質性短分支多糖，延伸至細胞間隙，連接不同類型蛋白質后構成細胞表型[36]。許多細胞表面分化抗原，如CD48、CD55以及CD59等，正是通過GPI錨連接在細胞膜表面形成不同細胞表型而發(fā)揮生物效應，所以當GPI錨無法正常合成時，造成細胞GPI錨鏈蛋白缺失。PIG-A基因突變的大多數(shù)研究源于一種稱為人陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)的臨床疾病，PNH為罕見的由相當大部分骨髓干細胞PIG-A基因突變所導致的獲得性遺傳損傷疾病[3]。由于骨髓干細胞為整個造血系統(tǒng)的先導，PIG-A基因突變會影響著許多細胞系的功能，包括紅細胞、粒細胞、單核細胞以及淋巴細胞等。PIG-A基因的突變間接地導致這些細胞表面GPI錨鏈蛋白的缺失，而一些GPI錨鏈蛋白已得到廣泛的研究，特別是CD55和CD59。

據(jù)Kawagoe等[4]報道，Pig-a基因的結構、位點和功能在不同動物種屬中均具有高度保守性，這也為在不同物種間建立體內Pig-a突變檢測方法提供了可能。Pig-a基因在小鼠中，與人的同源性為88%，在核心區(qū)域的同源性為94.5%。Pig-a基因編碼N-乙酰葡萄糖胺轉移酶復合物的催化亞基，參與GPI錨的早期生物合成。在合成GPI的整個過程中所涉及的基因包括Pig-a基因在內至少有12個。然而，只有Pig-a基因位于X染色體上，其他基因(如Pig-b和Pig-c等)均位于常染色體上[5]。由于在常染色體上兩個等位基因同時發(fā)生突變而導致GPI錨缺陷的事件非常罕見，而位于X染色體上Pig-a基因的單一突變即可使GPI錨無法表達，因此，GPI錨缺陷表型等同Pig-a基因突變，從而可通過檢測細胞表面GPI錨鏈蛋白來得知Pig-a基因突變的情況。該試驗方法具有較長的檢測窗，允許在試驗過程中重復采集樣本，能夠無創(chuàng)、持續(xù)、動態(tài)地監(jiān)測動物體內的突變反應，因而可較容易地整合至重復給藥毒性研究中，是極具發(fā)展前景的體內基因突變檢測方法。因此，可通過檢測細胞表面GPI錨鏈蛋白的缺失情況，以Pig-a基因突變率的變化來評價受試物的遺傳毒性。

2 Pig-a基因突變試驗的建立

1999年，Araten等[6]建議建立以Pig-a基因為報告基因的體內基因突變試驗方法；2008年，Bryce和Miura等[7-9]首次正式報道以此試驗方法開展臨床前遺傳毒性研究，試驗以SD大鼠為受試對象，每隔1 d腹腔注射N-乙基-N-亞硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)或灌胃給予7,12-二甲基苯并[a]蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)3次，以外周血紅細胞表面CD59的缺失率作為Pig-a基因突變的檢測終點，以噻唑橙作為核酸染料區(qū)分正染紅細胞與網(wǎng)織紅細胞，利用流式細胞儀分析這兩種細胞群中突變細胞的比例，正式展開Pig-a基因突變試驗在藥物安全評價領域的研究。由于GPI錨在不同物種間的生物合成高度保守，而且其合成起源于骨髓干細胞，在各類組織細胞及各系成熟紅細胞中均有表達。因此，Pig-a基因突變試驗可在不同動物種屬和不同類型組織中開展。目前，已初步在大鼠、小鼠、猴等動物種屬中開展了該試驗方法的研究，研究的組織或細胞類型包括外周血紅細胞、脾淋巴細胞和骨髓細胞等[10-11]。研究表明，在不同動物物種和不同組織細胞中均可檢測出Pig-a基因突變，而且誘發(fā)突變比自發(fā)突變有一定程度升高，由相同致突變物誘發(fā)的突變結果在不同物種間具有一致性。

3 體內Pig-a基因突變試驗

3.1 Pig-a基因突變檢測方法分類

3.1.1 流式細胞術檢測法流式細胞術檢測法最初源于對PNH的診斷方法。致突變物使Pig-a基因發(fā)生突變可導致細胞GPI合成障礙，致使細胞表面GPI錨鏈蛋白缺失，通過流式細胞儀分析細胞表型，即可得到Pig-a基因的突變情況。此方法的具體操作是利用熒光標記的單克隆抗體標記目標細胞表面至少一種GPI錨鏈蛋白(如CD59)以區(qū)分突變細胞與正常細胞，以及使用另外一種熒光標記抗體和(或)流式設門策略將不同細胞群區(qū)分，從而檢測目標細胞群中突變細胞的數(shù)量。例如，使用白細胞特異性抗體和散射光將外周血白細胞和血小板與目標細胞(紅細胞)區(qū)分[8]；又如使用核酸染料區(qū)分正染紅細胞與網(wǎng)織紅細胞和淋巴細胞[7]；此外還可以使用梯度離心法初步將血樣中的紅細胞、白細胞和血小板分離，富集紅細胞后再使用相應的抗體標記[12-13]。

GPI錨的合成起源于骨髓干細胞，其在多功能干細胞及各系成熟紅細胞中均有表達?；诹魇郊毎g的Pig-a基因突變檢測方法主要以外周血紅細胞或白細胞以及骨髓細胞為樣品來源，而較少使用實體組織的單一細胞作為檢測樣品，其主要原因是處理實體組織時很難獲得細胞膜完整且數(shù)量足夠的單一細胞。從實體組織中獲得某單一細胞通常需要對組織進行消化處理，而這種處理方式可能會破壞用于評估Pig-a基因突變情況的GPI錨及其錨鏈蛋白，從而人為地提高了樣品中突變細胞的比例。此外，一些特定類型的實質細胞(如上皮細胞)表面具有自身熒光性質，這可能會影響試驗結果的準確性，且不利于該試驗方法的開發(fā)[10]。

目前，已用于Pig-a基因突變試驗研究的單一細胞有大鼠紅細胞與網(wǎng)織紅細胞、小鼠紅細胞與網(wǎng)織紅細胞、大鼠T淋巴細胞、獼猴紅細胞以及人粒細胞[14-15]等。Miura等[8]以ENU為受試物，以40 mg/(kg·d)每隔1 d腹腔給藥3次，采用Anti-CD59/Anti-CD45抗體染色策略，成功在大鼠紅細胞中檢測出ENU誘導的Pig-a基因突變。由于成熟的紅細胞中無DNA結構，單一檢測紅細胞可能在結果判定上有所影響，因此Miura等在同一項研究中采用流式細胞術檢測法進一步檢測了大鼠脾T淋巴細胞CD48的缺失情況，綜合判定Pig-a基因突變率。研究結果顯示ENU誘導的紅細胞突變率與脾T淋巴細胞突變率具有一致性。

由于突變細胞非常稀少，采用流式細胞儀檢測時需要設置嚴格的電壓和(或)熒光補償才能從目標細胞群中鑒別出來。因為突變細胞缺失表面蛋白標記物而被識別，所以在樣品前處理時必須保證所有細胞能夠與各種抗體或反應試劑有效地結合，以及在分析時保證流式細胞儀能夠準確地分辨出標記抗體的正常細胞與未標記抗體的突變細胞。因此，熒光種類和數(shù)目的選擇、合理的設門策略以及對熒光信號重疊的合理解釋是流式細胞術檢測法的關鍵所在[16]。

3.1.2 有限稀釋克隆法另一種檢測方法為有限稀釋克隆法。該方法已用于大鼠脾T細胞和獼猴外周血T細胞的Pig-a/PIG-A基因突變檢測，且在人T淋巴細胞中已經(jīng)獲得了一些原始試驗數(shù)據(jù)[17]。氣單胞菌溶素前體(proaerolysin，ProAER)是一種細菌原毒素，淋巴細胞能夠將其轉變?yōu)槎舅?氣單胞菌溶素)。該細菌毒素直接與正常細胞的GPI錨(而不是錨鏈蛋白)特異性結合，導致細胞膜完整性受損以致細胞死亡[18]。因此，缺失GPI錨的Pig-a基因突變細胞能夠在含有ProAER的96孔板內生長集落，而未突變的T淋巴細胞則死亡。類似于Hprt基因突變試驗以6-TG作為選擇劑，有限克隆稀釋法則以ProAER作為選擇劑。其中不同的是，在Hprt基因突變試驗中與刺激T淋巴細胞增殖的分裂素相結合的受體需要GPI錨的正常表達，因此在Pig-a基因突變試驗中突變細胞的增殖方式會有所不同。

較流式細胞術檢測法而言，有限稀釋克隆法能夠更直觀地鑒別突變細胞，為在體內檢測Pig-a基因突變提供了另一個選擇，而且該方法的最大優(yōu)點在于獲得的有核突變細胞可用于更深入的研究，如突變譜的檢測和突變機制的分析等。但是，有限稀釋克隆法類似于Hprt基因突變試驗，需要體外細胞培養(yǎng)，耗時耗力，不便于推廣，而流式細胞術檢測法相對簡便、快速，省時省力，在應用方面更具有優(yōu)勢，更便于常規(guī)的檢測。因此，目前有關Pig-a基因突變試驗的研究大多數(shù)采用流式細胞術檢測法。

3.2 Pig-a基因突變試驗的特點

雖然Pig-a基因突變試驗已在獼猴、大鼠和小鼠等不同物種間開展，但目前針對該試驗方法的研究更多地集中在大鼠上，而且已采用大部分典型的陽性遺傳毒性化合物對其進行驗證。在Pig-a基因突變試驗方法的建立過程中，研究的主要關注點在于給藥時間或給藥方式對突變率的影響以及試驗方法的檢測窗、靈敏性、特異性、重現(xiàn)性和可轉移性等方面。

3.2.1 檢測窗Miura等[19]研究了在單劑量和累積劑量兩種給藥方案下ENU誘導大鼠產(chǎn)生的Pig-a突變型紅細胞在血液中的蓄積效應和持續(xù)時間。F344雄性大鼠分別給予單劑量腹腔注射8.9，35.6或142.4 mg/kg ENU；以及每周1次連續(xù)4周腹腔注射8.9和35.6 mg/kg ENU，于給藥前和給藥后26周里不同時間點采集血樣，用流式細胞儀檢測突變紅細胞(RBCCD59-)的發(fā)生率。研究顯示，單劑量ENU誘導的RBCCD59-發(fā)生率具有時間依賴性和劑量依賴性，其最大值開始于給藥后第6周，而且這些顯著的突變率一直持續(xù)至給藥后第6個月(最后一個采樣點)。而在累積劑量給藥方案中，分4次劑量每周1次給予ENU所誘導的Pig-a基因突變率與相同總劑量單次給藥所產(chǎn)生的突變率相似，即在兩種給藥方案下同一總劑量單次或分次給予ENU所誘導Pig-a基因突變率最大值非常接近。研究結果表明ENU誘導的Pig-a突變型紅細胞能夠以近似相加的方式在血液中蓄積，而且一旦在外周血出現(xiàn)就會存留至少6個月，這些特征為Pig-a基因突變試驗在亞慢性或慢性研究中檢測弱致突變物的遺傳毒性提供了可能。

黃色素的主要成分是類胡蘿卜素。類胡蘿卜素是生物體內通過類異戊二烯途徑合成而呈黃色、橙紅色和紅色的一大類萜類色素物質[1-2]。類胡蘿卜素又可分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類，胡蘿卜素是不含氧的類胡蘿卜素的總稱，葉黃素則是含氧類胡蘿卜素的總稱。面粉中的類胡蘿卜素，特別是葉黃素和黃酮類物質是面粉黃度形成的主要原因[3]。

在上述研究的基礎上，Phonethepswath等[13]觀察了突變型紅細胞(RBCCD59-和RETCD59-)在大鼠外周血中出現(xiàn)與消除的動力學變化，以探討該試驗方法合理的給藥時間與檢測窗口期。研究者們分別以ENU、DMBA、N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-Nitroquinoline-1-oxide，4NQO)和苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)等 5 種典型遺傳毒性陽性劑作用于雄性Wistar Han大鼠和SD大鼠(僅限ENU和DMBA)，連續(xù)3天灌胃給藥，于實驗第1、4、15、30、45、90以及180天(僅限ENU)采血，利用流式細胞儀檢測受試物誘導產(chǎn)生的RBC突變表型(RBCCD59-)和RET突變表型(RETCD59-)的發(fā)生率；同時嘗試以染色體損傷作為第2個遺傳毒性終點結合至該研究中，于實驗第4天采血檢測微核網(wǎng)織紅細胞(Micronucleated Reticulocyte，MN-RET)的發(fā)生率。研究結果顯示，以上5種陽性劑對兩種不同種屬的大鼠均產(chǎn)生Pig-a基因突變以及染色體損傷。不同受試物誘導的RBCCD59-和RETCD59-發(fā)生率一般從第15天開始出現(xiàn)顯著性遞增：RETCD59-發(fā)生率大約在兩周左右(第15天前后)達至峰值，而RBCCD59-發(fā)生率則需要大約45天才能達到峰值。此外，研究發(fā)現(xiàn)ENU誘導的RBCCD59-和RETCD59-持續(xù)存留于Wistar Han大鼠血液中至少6個月，這些研究結果與Miura等[24]的研究結果保持一致。

基于Phonethepswath等[13]的研究，Dertinger等[20]考慮到Pig-a突變型紅細胞在血液中的蓄積效應可能有利于Pig-a突變試驗與亞慢性或慢性毒性研究的整合，因此同樣以上述5種典型陽性劑在雄性Wistar Han大鼠中開展28天重復給藥研究，分別于試驗給藥前1天，首次給藥后第、15、29和56天采血進行外周血RBCCD59-和RETCD59-發(fā)生率的檢測，同時于實驗第4天和第29天采血檢測MN-RET，以探討將基因突變和染色體損傷兩個遺傳終點整合至28天重復給藥毒性試驗中的可行性，以及觀察這兩個遺傳終點在該試驗系統(tǒng)中的靈敏性。結果顯示，除了4NQO外，其余4個受試物均可導致MN-RET的發(fā)生；而所有受試物在28天重復給藥試驗系統(tǒng)中均可誘導Pig-a基因突變。研究表明突變反應較早地發(fā)生在RET，且RETCD59-發(fā)生率于實驗第29天接近峰值或達到峰值；然而，在實驗第29天時RBCCD59-的發(fā)生率遞增比較溫和，且需要更長的時間才能到達峰值(大約在第56天)。鑒于RET出現(xiàn)突變反應的時間較RBC早，而且RET出現(xiàn)峰值的時間與常規(guī)的28天重復給藥毒性研究的實驗期相對吻合。因此，Phonethepswath等和Dertinger等均建議將RETCD59-的發(fā)生率作為亞慢性或慢性毒性研究中Pig-a基因突變的檢測指標。

以上這些研究表明，Pig-a基因突變試驗具有較長的檢測窗，允許試驗過程中重復收集樣本檢測同一動物不同時間點的突變率，而且能夠檢測動物經(jīng)重復給藥后在體內蓄積的致突變作用。與其不同的是，一些常用的體內遺傳毒性試驗，如微核試驗和彗星試驗，必須在給藥后一個相對短的檢測窗內才能檢測到受試物對動物產(chǎn)生的遺傳毒性。因此，Pig-a突變試驗的這些優(yōu)點為其在亞慢性或慢性研究中的應用提供了可能。

3.2.2 靈敏性和特異性迄今的研究結果表明，在流式細胞術檢測法中大鼠RBC和RET的Pig-a基因自發(fā)突變率非常低(小于5×10-6)[13-14，20]，而在有限克隆稀釋法中脾淋巴細胞自發(fā)突變的背景值同樣相似[14]。這些紅系細胞在Pig-a位點上的自發(fā)突變背景值與淋巴細胞在內源性Hprt基因位點上的自發(fā)突變背景值非常具有可比性，而且遠低于大多數(shù)轉基因位點的自發(fā)突變背景值。報告基因低頻率的自發(fā)突變能夠有效提升該試驗方法的靈敏度，因此這些在Pig-a位點上相對低的自發(fā)突變背景值有望成為發(fā)展Pig-a基因突變試驗的一大優(yōu)勢。

對于RBC和RET的Pig-a的基因突變方面也有一定的差異，Yoshida[21]研究發(fā)現(xiàn)盡管芘在RBC Pig-a和PIGRET基因突變測中都是陰性，但是溶媒對照組Pig-a的突變頻率在兩種測定之間明顯不同。在溶媒對照組中，對于RBC Pig-a和PIGRET測定，試驗測試階Pig-a基因突變的頻率范圍分別為(2.2～4.8)×10-6和(0.3～1.3)×10-6。而在40 mg/kg ENU處理組中，PIGRET基因突變頻率相較于對照組的倍數(shù)(20.9倍)遠高于RBC Pig-a的基因突變頻率(13.7倍)。較低的溶媒對照組PIGRET的突變頻率可以提高該試驗的靈敏度，這也是PIGRET基因突變試驗的優(yōu)勢之一。此外，ENU10 mg/kg組和40 mg/kg組，PIGRET基因突變頻率明顯增加在7 d內，但RBC在ENU10 mg/kg組需要至少14 d來檢測Pig-a基因突變頻率的增加。由于在大鼠外周血中RETs的轉化時間比RBC更短，故PIGRET試驗可以比RBC Pig-a試驗更早地檢測ENU的致突變性。

至于鑒定已知致突變物和致癌物的能力方面，一項研究報道[22]采用41種化合物在大鼠上開展針對Pig-a基因突變試驗靈敏性的驗證試驗，其中包括26個在Ames試驗中呈陽性反應的化合物以及一些非遺傳毒性化合物。大部分預期在試驗中呈現(xiàn)陽性反應的受試物均可導致Pig-a基因突變。這些受試物除了包括一些直接與DNA反應的烷化劑外，還包括一些經(jīng)體內代謝活化后才能暴露出相應遺傳毒性的化合物，如2-乙酰氨基芴、馬兜鈴酸、二乙基亞硝胺、B[a]P和DMBA等[23]。這些化合物經(jīng)體內充分活化后，其代謝產(chǎn)物因破壞紅系前體細胞而產(chǎn)生陽性結果。另一方面，Pig-a基因突變試驗對于假定的非遺傳毒性化合物也呈現(xiàn)出一定特異性，如鹽酸哌醋甲酯[18]和芘[37]。上述資料顯示，該試驗方法已經(jīng)呈現(xiàn)出較高的靈敏性(即檢測遺傳毒性致癌物的能力)和特異性(即正確識別所有非遺傳毒性化合物的能力)。

盡管個別陽性劑(如ENU和DMBA)在Pig-a基因位點上的致突變作用較為強烈，但是其他一些化合物(如B[a]P和4-NQO)經(jīng)短期暴露后產(chǎn)生的致突變作用則相對溫和。在這些情況下，報告基因相對低的自發(fā)突變背景值有助于提高試驗方法的靈敏性。為了比較Pig-a基因與其他現(xiàn)有的報告基因對化合物致突變作用的敏感性，Miura等[24]在同一批大鼠上比較了ENU(100 mg/kg)誘導紅細胞與T淋巴細胞在Pig-a基因位點和Hprt基因位點上的突變反應。他們使用流式細胞術檢測法對比紅細胞和T淋巴細胞的Pig-a基因突變率，同時使用有限克隆稀釋法對比T淋巴細胞在Pig-a基因位點和Hprt基因位點上的突變反應。另一個相似的研究則在少數(shù)獼猴上進行，Dobrovolsky等[12]同樣對比了ENU誘導紅細胞與T淋巴細胞在Pig-a基因位點上的突變反應，同時對比了T淋巴細胞的Pig-a基因突變率和Hprt基因突變率。這兩項研究的結果顯示，無論是在Pig-a基因位點還是Hprt基因位點上，ENU誘導的紅細胞和T淋巴細胞突變率均具有可比性。此外，Lemieux等[25]采用MutaTMMouse轉基因模型對比研究了連續(xù)28 d重復給予B[a]P后誘導網(wǎng)織紅細胞的Pig-a基因突變率和骨髓細胞的lacZ基因突變率。研究者們發(fā)現(xiàn)在這兩個基因位點上的突變率均呈現(xiàn)雙倍劑量性遞增，且在不同劑量組中出現(xiàn)非常相似的劑量依賴性動力學變化。盡管這些研究顯示不同報告基因對化合物致突變作用的敏感性存在差異，但目前在致突變物和報告基因沒有得到充分研究的情況下對Pig-a基因突變試驗的靈敏性下定論尚為時過早。

本課題組經(jīng)幾年的實驗研究，形成了本實驗室可行且穩(wěn)定的實驗方法，蒲江等[32]對實驗方法進行建立、優(yōu)化，并做了進一步的評估。該研究選用合適的陽性劑EMU和DMBA，得到與溶劑對照組相比Pig-a基因突變頻率存在顯著性差異的結果。陳高峰[15]等采用免疫磁性分離的方法對試驗體系進行進一步的優(yōu)化并應用于市售的藥物，研究把鹽酸丙卡巴肼與烏拉坦作為受試物采用多終點結合體內遺傳毒性進行研究，試驗分為3 d和28 d給藥組。研究結果顯示經(jīng)PCZ與EC短期及長期暴露后，與對照組相比RETCD59-和RBCCD59-發(fā)生率均呈現(xiàn)明顯的時間依賴性和劑量依賴性變化。兩種受試物在Pig-a基因突變試驗、外周血微核試驗、骨髓微核試驗和彗星試驗均呈現(xiàn)陽性反應。

4 體外Pig-a基因突變試驗

隨著動物實驗“3R”原則的提出，體外Pig-a基因突變試驗的形式能夠實現(xiàn)對動物體內試驗的替代，且為體內試驗提供預測形成互補。盡管存在實際試驗需求，但體外Pig-a基因突變試驗在國內外的研究進展卻十分緩慢。2015年Kruger等[33]人建立了相應的Pig-a體外變異體B淋巴母細胞樣TK6細胞的檢測方法，通過多色流式細胞術用抗GPI錨定蛋白CD55和CD59的PE-抗體結合物檢測GPI狀態(tài)，對突變的TK6細胞樣品進行分析，并對突變體進行定量檢測，試驗結果證實體外Pig-a基因突變法檢測甲基磺酸乙酯、4-硝基喹啉1-氧化物和UV-c輻射的致突變性，結果顯示劑量依賴性且有統(tǒng)計學意義，表明體外Pig-a試驗可以補充體內Pig-a試驗，與其他哺乳動物體外致突變試驗相比，具有明顯的優(yōu)勢。隨后，Kruger等[34]又對TK6細胞GPI相關基因型與表型的關系進行了研究。David R[35]在之前研究的基礎上，建立并驗證一種對小鼠淋巴瘤細胞L5178Y體外Pig-a基因突變的檢測方法，試驗中采用的細胞系與Kruger等有所不同，David R采用小鼠淋巴瘤細胞L5178Y代替Kruger試驗中采用的TK6細胞，考慮到TK6細胞比L5178Y細胞有較高的Pig-a自發(fā)突變背景值，需清除預先存在的自發(fā)突變細胞，降低試驗中存在的自身突變對于試驗結果的影響，L5178Y就以上原因而言存在有一定優(yōu)勢。

Rees[36]等人主要研究了人類細胞：TK6細胞，AHH-1細胞以及MCL-5細胞的體外PIG-A的基因突變。由于TK6細胞自身存在較高的背景突變值，試驗中采用了3種不同的方法對用于優(yōu)化TK6細胞內CD59表達的富集策略進行了比較，研究數(shù)據(jù)表明：熒光激活細胞分選法在平均CD59野生型富集方面有最佳效果，野生型細胞富集率達(95.3±3.0)%，Dynabead?磁珠檢索和克隆擴增分別產(chǎn)生(89.1±6.5)%和(70.8±25.3)%的CD59細胞陽性率。在不同的細胞系之間，該研究表明，MCL-5細胞內的獨立PIG-A測定比基于TK6細胞的測定更有前途。

5 Pig-a基因突變試驗的應用前景

Pig-a基因突變試驗能夠跨物種跨組織檢測體內多種類型的突變作用，并能有效整合至其他體內試驗中，在藥物臨床前安全性評價中具有非常廣闊的應用前景，有望成為體內遺傳毒性試驗的新選擇，從而彌補現(xiàn)有遺傳毒性試驗組合的不足。相對于體外Hprt基因突變試驗等以及體內試驗方法，以外周血紅細胞和網(wǎng)織紅細胞為檢測靶點的Pig-a基因突變試驗具有快速簡便及實用性強等優(yōu)點。而且，該試驗方法檢測窗較長，允許在試驗過程中重復采集樣本，無創(chuàng)、連續(xù)、動態(tài)地監(jiān)測動物體內的突變反應，并可在不影響其他檢測終點的前提下將試驗整合至藥物亞慢性或慢性毒性研究中，符合ICH遺傳毒性試驗指導原則S2(R1)對動物實驗“3R”原則的要求，適應當前藥物毒理學研究和安全性評價的發(fā)展趨勢。在基于大鼠外周血的測定中，通過熒光標記的抗體結合流式細胞術來定量分析紅細胞表面上缺失CD59的數(shù)目以確定Pig-a突變表型細胞的頻率。該試驗已達到監(jiān)管的可行性，因此該試驗方法建議作為的ICH M7[37]步驟4文件中細菌突變試驗在非S9代謝活化條件下結果為陽性時的追蹤實驗。

該方法應用于藥物遺傳毒性評價仍需大量的研究和驗證工作，以及需要積累更多數(shù)據(jù)對其方法進行標準化。除了采用更多的弱致突變物或非致突變物對方法的靈敏性和特異性進行驗證外，還需開展研究證實GPI錨鏈蛋白的缺失真正源于Pig-a基因位點上的突變，而非由基因沉默或預先存在的突變體克隆擴增而導致。此外，還需研究是否能將該方法應用至有核的非紅細胞系(如粒細胞和淋巴細胞)或其他實體組織細胞上(如肝和腎)。相信在國內外相關領域研究人員的共同努力下，Pig-a基因突變試驗定能得到進一步發(fā)展與完善，在藥物非臨床遺傳毒性研究以及其他領域中發(fā)揮重要作用。