吳軍，胡龍霞，劉文斌

1武漢輕工大學醫(yī)學技術與護理學院，武漢430023

2解放軍空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院/西京醫(yī)院護理部，西安710032

3華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，武漢4300220

胸腹腔腫瘤切除手術常有腫瘤細胞脫落并發(fā)生腫瘤轉移復發(fā)，其中以胃癌、肝癌、肺癌、食管癌較多見[1-4]。腫瘤細胞脫落與腫瘤患者的漿膜受累程度、TNM分期、腫瘤浸潤深度、病理分型、分化程度、淋巴結轉移情況及術后轉移類型等有關[4-7]。同時，手術也可以增加腫瘤細胞脫落或激活休眠的腫瘤細胞，這類因手術脫落游離且有生物活性的腫瘤細胞即為游離腫瘤細胞（free-tumor cell，F(xiàn)TC），由FTC形成的亞臨床轉移灶是腫瘤術后播散、轉移、復發(fā)的主要原因[5]，也是腫瘤患者預后的獨立影響因素[8-9]。無瘤技術是指在惡性腫瘤切除手術過程中為了防止或減少腫瘤細胞的脫落、種植和播散而采取的一系列措施，其主要目的是在手術始末滅活、清除FTC，對預防腫瘤轉移、復發(fā)具有重要意義，而其中關鍵的環(huán)節(jié)是胸腹腔沖洗[10]。然而，胸腹腔沖洗時，沖洗液體的選擇在諸多研究中各有不同，并且沖洗的條件也有差異。腫瘤復發(fā)的模式中有腫瘤細胞的胸膜/腹膜播散、術中脫落種植，而胸腹腔沖洗則可以降低脫落腫瘤細胞的陽性率，從而降低腫瘤轉移復發(fā)率。1989年，Paget提出的“種子-土壤”學說提到，胸腹腔內腫瘤細胞經多種途徑脫落，形成“種子”，手術及創(chuàng)傷性操作等機械性損傷使腹膜間皮組織裸露形成所謂的“土壤”，兩者相互作用與其他細胞、化學因子等共同促使FTC轉移和腫瘤復發(fā)。

1 無瘤技術滅瘤原理

1.1 蒸餾水和生理鹽水滅瘤原理

蒸餾水屬于不含有形成分和雜質并且滲透壓接近于零的低滲液體，人體組織細胞的滲透壓為280～310 mOsm/L，因而蒸餾水可以使腫瘤細胞腫脹、裂解，進而滅活腫瘤細胞。由于蒸餾水是低滲液體，其在使腫瘤細胞腫脹的同時也會對正常組織細胞造成損傷，從而影響吻合口愈合；另外，氯離子通道會因競爭或阻斷而增強細胞毒作用及加劇低滲性休克。相關研究表明，術后蒸餾水沖洗浸泡后，胃癌患者有血壓降低、房性早搏等不良反應發(fā)生[11-12]。目前，多數(shù)研究支持生理鹽水替代蒸餾水作為腫瘤手術的常規(guī)沖洗液[13-14]。

1.2 聚維酮碘溶液和乙醇滅瘤原理

表面活化劑聚維酮碘起著載體和協(xié)助溶解的作用，在膠粒束中央可以運載不定型的絡合物，隨著聚維酮碘被稀釋而逐漸釋放游離碘。游離碘結合有機物后能夠迅速地表現(xiàn)出細胞毒性，在短時間內對細胞蛋白產生不可逆性交聯(lián)作用并殺死原核細胞，對多種細菌、病毒等均有殺滅作用。游離碘被消耗后，絡合狀態(tài)的聚維酮碘又可以釋放游離碘，直到可利用的碘被消耗完全。乙醇是蛋白質活性的強烈抑制劑，不僅能夠直接固定和破壞細胞內的蛋白質、酶等，而且還可以使腫瘤細胞迅速脫水，從而使腫瘤細胞發(fā)生不可逆轉的變性而被滅活[15-16]。但是，交聯(lián)的蛋白會形成保護層，當滅活腫瘤細胞粘黏或重疊時，將會影響乙醇滲透到深層細胞，導致內層細胞的滅活效果欠佳。因而，有研究采用肝素無水乙醇沖洗腹腔，以減少FTC的粘黏[17]。

2 FTC檢測方式

2.1 腹膜細胞學

腹膜細胞學（peritoneal lavage cytology，PLC）屬于病理細胞學（cytopathology，CP）的一種，是檢測FTC存在的金標準[5,18]，其診斷依賴于細胞形態(tài)學的改變。PLC不僅可以甄別腫瘤細胞的亞顯微結構，而且還可以用來進行腫瘤細胞滅活后計數(shù)，對甄別微量腫瘤細胞的特異度較好但靈敏度欠佳[19]。PLC的陽性率較低、漏診率高，尤其當腫瘤細胞較少并散布在炎性細胞和間皮細胞間時，依靠細胞形態(tài)學作出診斷的難度則大大增加；而且，在沖洗過程中腫瘤細胞往往有較明顯的退變現(xiàn)象，更增加了診斷的難度[20-21]。

2.2 流式細胞術

流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）可以定性或定量分析細胞，檢測FTC的靈敏度高、速度快、可靠性好。結合分子的特異性和分子生物學方法，常用消化道腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角蛋白 20（cytokeratin 20，CK20）及上皮細胞膜抗原（epithelial cell membrane antigen，EMA）檢測腹腔腫瘤術后的FTC[22-23]。

2.3 免疫組織化學法

免疫組織化學法（immunocytochemistry，ICC）檢測時干擾因素較少，檢出率高，操作簡單快捷，結合PLC的效果更為明顯，尤其在胃癌術后FTC的檢測中應用較多。腹腔沖洗液中FTC經過富集后，通過ICC檢測EMA、CEA、CK20等大分子，可以證明FTC存在及計算FTC的數(shù)量[5-6]。

2.4 其他檢測技術

在微量腫瘤細胞的檢測中，逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術顯示出很好的特異度（48.5%）和靈敏度（55.8%），RT-PCR主要用于篩查信使RNA（messenger RNA，mRNA）[19]，對mRNA采集和檢測的要求很高，操作復雜，需要嚴格對照，費用昂貴[6]；而針對細胞活性測定的磁激活細胞分離術（magneticactivated cell separation，MACS）[24]、臺盼藍染色法和噻唑藍法也是FTC檢測的常用方法[25]。

3 體腔沖洗條件

3.1 沖洗液的溫度

熱療能使腫瘤細胞表面結構蛋白變性，改變細胞膜的通透性。相關研究表明，24～26℃的沖洗液會增加患者心腦血管意外、術后腹腔內感染和切口感染的風險，失血量也可能增加，并且還會對機體的凝血功能和免疫功能造成不同程度的抑制[9,26]。30℃沖洗液沖洗前后患者的生命體征有明顯變化[8,27]；常溫沖洗可以有效減少腫瘤切除術后腹腔壁FTC的粘黏。35～40℃接近患者的體腔溫度[28]，36～38℃常為體溫維持溫度，沖洗過程中患者的生命體征平穩(wěn)無波動，40～43℃雙蒸餾水可以使腫瘤細胞呈破碎樣改變，而且對正常組織不會造成明顯傷害[28]，超過45℃時正常組織便會受到不可逆損傷。41℃生理鹽水沖洗可以明顯減少患者術后低體溫（手術中體溫≤36℃）、寒顫的發(fā)生，而且利于血乳酸的清除，降低患者的胰島素抵抗（insulin resistance，IR），減輕應激反應。相關研究表明，42.5℃/43℃沖洗液沖洗時腫瘤細胞可出現(xiàn)不可逆損傷[29-30]，但目前尚無研究闡明0.5℃的溫度差。43～45℃沖洗液沖洗時除了可以增加細胞的通透性外，還可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[31]。腹腔熱灌注化療（chemotherapeutic hyperthermic intraperitoneal perfusion，CHIP）中采取 47～50℃沖洗液，當沖洗液溫度為50～55℃時，F(xiàn)TC會很快死亡[30,32]，該溫度對正常細胞的損傷也很大。但在動物研究中，40～44℃條件下沖洗則可以選擇性地殺滅FTC[33]，這在使用蒸餾水和生理鹽水作為沖洗液時尤為典型，但是肺癌術中進行切口及胸腔滅瘤沖洗時首選43℃的聚維酮碘稀釋液[34-35]。

3.2 沖洗液的濃度

75%～95%乙醇滅菌效果優(yōu)于生理鹽水，乙醇濃度（＜95%）越高，對骨腫瘤細胞的滅活效果就越明顯，但是40%乙醇對食管腫瘤細胞的抑制作用較75%乙醇更為明顯[36-37]。有效碘稀釋度為0.01%～0.50%，隨著稀釋倍數(shù)的增加，游離碘濃度不斷升高，抗菌滅瘤活性也不斷增強，提示聚維酮碘滅瘤作用的強弱與聚維酮碘的濃度有關，而0.25%～1%聚維酮碘溶液有同等滅菌效應[38]。0.5%的聚維酮碘溶液為臨床常規(guī)用藥，不僅可以達到滅菌效果[39]，還可以促進局部傷口愈合，并且不用配制，可直接使用并且取材快速、方便、成本低。1%～2%聚維酮碘溶液能夠滅活多種腫瘤細胞，但是對正常細胞也有一定的細胞毒性。43℃下0.05%聚維酮碘的抑瘤率最高，但也有研究表明1%的聚維酮碘溶液是在安全范圍內具有最強殺傷效果的濃度[40]。5%聚維酮碘在小鼠實驗中被證明滅活結腸癌FTC的效果明顯[41-42]，10%聚維酮碘溫熱胸腔沖洗和輔助化療可以降低胸膜間質瘤的復發(fā)率[43]。

3.3 沖洗次數(shù)和灌洗液體積

體外研究表明，蒸餾水沖洗2～3次滅活FTC的效果比沖洗1次要明顯，沖洗次數(shù)大于4次，F(xiàn)TC滅活效果與沖洗3次無差異[21,44]。但是腫瘤切除術后無水乙醇沖洗1次的滅瘤效果就已相當于蒸餾水沖洗3次。腫瘤切除手術中，為了減少或滅活FTC，術者常用1.0～4.5 L沖洗液沖洗腹腔，綜合相關研究提示，平均會用去（2000±500）ml沖洗液[36,45]。

3.4 沖洗的時間

蒸餾水浸泡5 min即可殺滅器械上的FTC，沖洗14 min后可以引起腫瘤細胞裂解，沖洗32 min后基本可以殺死腹腔脫落的腫瘤細胞。0.01%聚維酮碘作用于結腸腫瘤細胞1 min即可出現(xiàn)明顯的生長抑制作用并誘導細胞凋亡，器械浸泡于40℃的0.5%聚維酮碘溶液10 min的滅瘤率能達到90%以上，但在體內的研究表明，該條件下熱化療不能達到上述效果[41]。亦有蒸餾水或生理鹽水沖洗15、30、45、60 min的研究，在研究無水乙醇滅活FTC時間區(qū)間5～60 s時，10 s FTC滅活率即可達到95%，15 s后趨向穩(wěn)定且皆大于99%[23,39]。

3.5 其他條件

微波滅瘤原理類似于高溫滅菌，常用溫度為40～60℃，時間為10～30 min，該類研究以體內研究為主[46]。滅活腫瘤細胞時，在43℃30 min條件下，F(xiàn)TC的滅活率僅為18%，相同時間內溫度提升1℃，F(xiàn)TC的滅活率可達到85%。光波分為不可見光和可見光，不可見光有紅外線與紫外線，紅外線滅瘤原理為加熱，紫外線滅瘤原理為直接破壞DNA，兩者的滅瘤效應與強度和時間成正比；可見光主要激發(fā)核黃素產生光化學反應從而滅活FTC。磁場效應主要是利用Fe3+（Fe3O4）納米粒子對細胞產生效應，如電泳作用，并對細胞培養(yǎng)液中的負電荷離子的移動速度和排列形式產生影響，使細胞表面蛋白分子帶電荷能力和分布改變，最終導致細胞的生物學行為改變[25,47]。

相關研究認為，單純沖洗難以充分滅活FTC，故額外加入5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑、四環(huán)素、慶大霉素等化療藥物或抗菌藥物進行持續(xù)腹腔沖洗/CHIP以增強滅瘤效應[25,48]，這是胃腸癌術后預防腹腔種植和肝轉移較重要的手段。甚至有研究將氯己定混入沖洗液以增強FTC的滅活效果，亦有單獨探討Cl-1滅瘤效果的研究。

4 小結與展望

醫(yī)源性種植即術中接觸腫瘤的手套、器械、紗布等相關物品都可以導致腫瘤細胞在手術區(qū)域的播散種植、切口種植或局部復發(fā)等。在手術操作過程中一定要嚴格執(zhí)行無瘤技術，體腔探查動作要輕柔，嚴禁對腫瘤進行擠壓，探查遵循由遠及近原則，最后探查原發(fā)腫瘤及受累臟器，探查完畢后，更換手套。研究表明，胸腹腔腫瘤切除術后沖洗可以減少FTC并且預防腫瘤胸腹膜種植轉移，降低復發(fā)率，對提高患者的生活質量有明顯作用。但是術后FTC滅活常因患者耐受性和施術者的差異，而選擇不同的沖洗液及其沖洗條件。中國學者常常在患者手術后取樣，側重體內研究；國外學者常在動物試驗中探索，偏向于體外模擬。

綜上所述，F(xiàn)TC檢出率與TNM分期、淋巴細胞浸潤、轉移類型、病理類型等密切相關，但是少有研究說明這是否會增加PLC的假陽性率。無論原來已有的FTC，還是沖洗過程中增加的FTC，通過檢測滅活率都能說明沖洗的有效性。但是針對靈敏度低的FTC檢查假陰性率是否會增加，已有研究未予以說明。沖洗條件如沖洗次數(shù)、溫度會影響FTC檢出陽性率，甚至已有研究得出某些沖洗條件明確范圍，綜合文中所述，這些條件也存在分歧，這就給將來可重復性、具體化研究奠定了一定基礎。