翁美玲，吳錫林，陳建新，鄭勤紅

(衢州市人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，浙江 衢州 324000)

惡性程度高、難以早期發(fā)現(xiàn)、手術(shù)切除率低、高侵襲性、對(duì)放化療欠敏感等因素導(dǎo)致了胰腺癌治療難度大，生存期短。有報(bào)道預(yù)測[1]，2018年美國新發(fā)胰腺癌病例將高達(dá)55 440 例，死亡病例約達(dá)44 330例，占男性惡性腫瘤死因第3位、女性第4位。在中國，2015年新發(fā)胰腺癌9萬余人，發(fā)病率居惡性腫瘤第9位；死亡人數(shù)達(dá)7.9萬人，死亡率居惡性腫瘤第6位[2]。SPl (specificity protein 1)蛋白和HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α)都參與調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)通路的異常激活[3-4]，本文檢測SP1和HIF-1α在胰腺癌中的表達(dá)并分析其與胰腺癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年1月—2015年12月于衢州市人民醫(yī)院收治的未經(jīng)放化療的胰腺癌手術(shù)標(biāo)本共42例，其中男22例，女20例；年齡28～75歲，平均58.10±10.30 歲，≤60歲20例，>60歲22例；病理類型均為腺癌，高分化13例，中分化24例，低分化5例；腫瘤直徑大小≤2cm者9例，>2cm者33例；胰頭頸癌35例，胰體尾癌7例；浸潤深度為T1+T2者14例，T3+T4者28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例；術(shù)前血液 CA199≤300 U/mL者30例，CA199>300 U/mL者12例；按照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第八版胰腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期14例，Ⅱ期24例，Ⅲ期4例，IV期0例。同時(shí)選取癌旁組織15例，其中男8例，女7例；≤60歲7例，>60歲8例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所選患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法 4 μm胰腺癌及癌旁組織石蠟標(biāo)本切片中SP1和HIF-1α的表達(dá)采用免疫組化法測定，兔抗人SP1多克隆抗體濃縮液購自美國Bioworld Technology公司，兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體濃縮液、SP通用型兩步法檢測試劑盒、DAB顯色液試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。免疫組化步驟按照試劑盒說明進(jìn)行，胰腺癌標(biāo)本陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS液置換一抗作為陰性對(duì)照。采用查詢住院病例與電話隨訪相結(jié)合的方式(隨訪時(shí)間截止至2016年12月31日)記錄總生存期(overall survival, OS)，OS即由確診之日起至死亡或者末次隨訪的時(shí)間，時(shí)間以月為單位計(jì)算。

1.3 結(jié)果判定 SP1蛋白定位于胰腺癌細(xì)胞核中，細(xì)胞核呈棕黃色為陽性細(xì)胞；HIF-1α蛋白定位于胰腺癌細(xì)胞漿中，胞漿內(nèi)含有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。SP1和HIF-1α結(jié)果的判定分別根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例判定：染色強(qiáng)度無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；每張切片隨機(jī)選取4個(gè)高倍鏡(×400)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞比例，0%為0分，>0%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞比例評(píng)分之和≤4分為陰性，>4分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，生存期分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP1和HIF-1α在胰腺癌組織的表達(dá) 胰腺癌組織中SP1的陽性率為69.05%(29/42)，癌旁組織中陽性率為20.00%(3/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；胰腺癌組織中HIF-1α的陽性率為64.29%(27/42)，癌旁組織中陽性率為0(0/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；見圖1。

2.2 胰腺癌組織中SP1和HIF-1α的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 在胰腺癌組織中，SP1的表達(dá)與患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤大小、原發(fā)部位、分化程度及術(shù)前CA199水平無關(guān)(P>0.05)。HIF-1α的表達(dá)與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與性別、年齡、原發(fā)部位、浸潤深度、分化程度及術(shù)前CA199水平無關(guān)(P>0.05)(表 1)。

A：SP1的陽性表達(dá)；B：SP1的陰性表達(dá)；C：HIF-1α的陽性表達(dá)；D：HIF-1α 的陰性表達(dá)。圖1 SP1和HIF-1α在胰腺癌組織的表達(dá)(×200)

臨床病理特征例數(shù)SP1陽性(例)χ2PHIF-1α陽性(例)χ2P性別男2218女20113.5250.06013140.5430.461年齡≤60歲2012>60歲22171.4620.22715121.9090.167腫瘤大小≤2 cm98>2 cm33211.0940.2962256.6500.010浸潤深度T1+T2146T3+T428235.0270.0257201.8670.172淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無3017有12125.6400.01816113.9430.047TNM 分期Ⅰ期146Ⅱ期2419Ⅲ期448.2870.016419413.4320.001原發(fā)部位頭頸部3523體尾部760.3560.5502160.7470.388分化程度高分化1311中分化2416低分化523.5270.171101431.3710.504術(shù)前CA199水平≤300 U/mL30 19>300 U/mL12100.8050.3701890.3140.575

2.3 胰腺癌組織SP1和HIF-1α的表達(dá)與生存期的關(guān)系 SP1陽性患者的中位總生存期(mOS)為15.1±1.5個(gè)月，低于SP1陰性患者的19.4±1.2個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見圖2A。HIF-1α陽性患者的mOS為14.5±1.4個(gè)月，低于HIF-1α陰性患者的20.7±0.9個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見圖2B。

2.4 SP1、HIF-1α在胰腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性及其聯(lián)合表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 胰腺癌組織中SP1和HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.361，P=0.019)，見表2。SP1、HIF-1α均為陽性的胰腺癌患者mOS為12.2±0.9個(gè)月，SP1陽性、HIF-1α陰性的患者mOS為19.7±1.3個(gè)月，SP1陰性、HIF-1α陽性的患者mOS為17.6±1.1個(gè)月，SP1、HIF-1α均陰性的患者mOS為23.4±1.3個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖3。

A：SP1；B：HIF-1α。圖2 SP1和HIF-1α陽性和陰性胰腺癌患者的生存曲線

HIF-1αSP1陰性陽性總計(jì)陰性8715陽性52227總計(jì)132942

圖3 SP1 和HIF-1α聯(lián)合檢測與胰腺癌患者生存期的關(guān)系

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)啟動(dòng)子上有HIF-1α、SP1結(jié)合位點(diǎn)，近端是富含GC/GT區(qū)域，SP1與其結(jié)合上調(diào)VEGF表達(dá)。於永愛等[5]檢測SP1在卵巢癌中的表達(dá)率為42.5%，顯著高于良性上皮性腫瘤組(15.0%)。晚期卵巢癌組SP1表達(dá)率上升(57.14%)，顯著高于早期卵巢癌組(26.32%)。洪亮等[6]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中SP1表達(dá)率(74.68%)明顯高于癌旁組織(21.52%)。王時(shí)光等[7]從形態(tài)學(xué)和分子學(xué)證實(shí)缺氧上調(diào)了HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchumal transition, EMT)及侵襲遷移。賈如江等[8]檢測了HIF-1α在胰腺癌組織中陽性率為52.4%，其表達(dá)與分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)受侵及脈管癌栓有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中SP1和HIF-1α的陽性率明顯高于癌旁組織中的陽性率；SP1的表達(dá)與患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，HIF-1α的表達(dá)與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)；提示SP1可能參與了胰腺癌的浸潤與淋巴道轉(zhuǎn)移，HIF-1α可能參與了胰腺癌的生長及淋巴道轉(zhuǎn)移過程。

在胰腺癌中，VEGF是重要的促腫瘤新生血管形成因子，PI3K/AKT通路參與了SP1對(duì)VEGF的正向調(diào)控，該通路的激活也可促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)VEGF的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，SP1、HIF-1α在胰腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)性，提示SP1和HIF-1α調(diào)控VEGF的機(jī)制雖不盡相同，但可能存在一定的協(xié)同作用。本研究結(jié)果還顯示，SP1和HIF-1α均陽性患者生存期明顯比單個(gè)蛋白陽性的患者短，SP1和HIF-1α均陰性患者生存期最長，提示聯(lián)合檢測兩個(gè)蛋白可能有助于預(yù)測胰腺癌的預(yù)后。