馬從乾，王雅#，王娜，楊柯，陳德才

鄭州大學(xué)附屬南陽(yáng)市中心醫(yī)院1血管外科，2血液凈化科，河南 南陽(yáng) 4730000

血管瘤是一種常見的良性腫瘤，對(duì)于導(dǎo)致患者出現(xiàn)潰瘍、功能障礙、瘢痕等并發(fā)癥的血管瘤，必須給予早期干預(yù)治療[1]。研究血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（hemangioma endotheliar cell，HemEC）的增殖、凋亡等生物學(xué)行為的機(jī)制，可為研究血管瘤的發(fā)生、發(fā)展和退化奠定一定的基礎(chǔ)[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及增殖等作用[3-4]。Ou等[5]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）在血管瘤組織中的表達(dá)水平高，且與血管瘤細(xì)胞的存活和凋亡密切相關(guān)。Teng等[6]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)其遷移。LINC00152是一種lncRNA，結(jié)合諸多相關(guān)研究，篩選出與LINC00152結(jié)合的miRNA均可靶向抑制VEGFR2基因的表達(dá)[7-12]，提示 LINC00152 與VEGFR2可能具有相關(guān)性。因此，本研究分析了LINC00152在不同時(shí)期血管瘤組織和癌旁正常皮膚組織中的表達(dá)情況，并探討LINC00152對(duì)Hem-EC生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲的影響及具體作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病理組織收集

收集2010年10月至2016年10月于鄭州大學(xué)附屬南陽(yáng)市中心醫(yī)院保存的嬰幼兒血管瘤患者的血管瘤組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)術(shù)后病理診斷確診為嬰幼兒血管瘤；②術(shù)前均未行任何輔助性治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在哮喘、嚴(yán)重先天性心臟病、低血糖等服藥禁忌證；②合并嚴(yán)重肝、腎功能不全；③出生時(shí)合并新生兒窒息或新生兒缺血缺氧性腦病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入27例嬰幼兒血管瘤患者的血管瘤組織標(biāo)本（血管瘤增生期組織標(biāo)本15例，血管瘤退化期組織標(biāo)本12例）。27例嬰幼兒血管瘤患者中，男10例，女17例；年齡為1個(gè)月～2歲，平均年齡為（1.2±0.1）歲；依據(jù)Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)[13]：處于增生期血管瘤患者15例，處于退化期血管瘤患者12例；另選取相應(yīng)的癌旁（距腫瘤邊緣5 cm以上）正常皮膚組織標(biāo)本27例作為對(duì)照。

1.2 試劑與儀器

Endothelial Basal Medium-2培養(yǎng)基購(gòu)于上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；SYBR Green Gene Expression Assay購(gòu)于日本TaKaRa公司；胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本Dojindo研究所；基質(zhì)膠Matrigel購(gòu)于美國(guó)BD Biosciences公司；MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRTPCR）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；EdU增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于 美 國(guó) Invitrogen 公 司 ；sh-LINC00152、pcDNALINC00152、miRNA-inhibitor、miRNA-mimic、pcDNA和siRNA Control均購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miRNA-200c-5p agomir和miRNA-195-5p agomir購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司；細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡免疫熒光試劑盒均購(gòu)于廣州復(fù)能基因有限公司。VEGFR2單抗、GAPDH單抗和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；SKLB1002購(gòu)于北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 qRT-PCR法檢測(cè)組織中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量 采用qRT-PCR法檢測(cè)LINC00152的相對(duì)表達(dá)量。嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說(shuō)明書的步驟提取血管瘤增生期組織、血管瘤退化期組織和癌旁正常皮膚組織中的總RNA。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green Gene Expression Assay進(jìn)行熒光定量PCR，20 μl反應(yīng)體系（SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，正向引物2 μl，反向引物2 μl，DEPC-H2O 4 μl）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃擴(kuò)增30 s，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用相對(duì)定量 2-△△Ct法計(jì)算LINC00152的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 HemEC培養(yǎng) 參考李鵬等[14]的方法進(jìn)行HemEC原代培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和雙抗的Endothelial Basal Medium-2培養(yǎng)基對(duì)HemEC進(jìn)行體外培養(yǎng)。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 HemEC轉(zhuǎn)染及分組 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)pcDNA-LINC00152的細(xì)胞分別記為OE-Linc1組和OE-Linc2組（分別擴(kuò)增兩個(gè)含有LINC00152序列的不同片段進(jìn)行過(guò)表達(dá)），將轉(zhuǎn)染pcDNA空載體的細(xì)胞記為OE-NC組，將轉(zhuǎn)染sh-LINC00152的細(xì)胞分別記為sh-Linc1組和sh-Linc2組（分別采用兩個(gè)不同LINC00152片段進(jìn)行干擾），將轉(zhuǎn)染sh-LINC00152對(duì)照的細(xì)胞記為sh-NC組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作，經(jīng)鑒定若轉(zhuǎn)染效率大于90%，則用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以過(guò)表達(dá)LINC00152（OE-Linc1組）的HemEC為基礎(chǔ)，將細(xì)胞分為SKLB1002組（采用300 nmol/L SKLB1002處理）、miRNA-200c-5p組[采用400 nmol/L miRNA-200c-5p miRNA模擬物（agomir）處理]和miRNA-195-5p組（采用400 nmol/L miRNA-195-5p agomir處理），檢測(cè)對(duì)各組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HemEC中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量 HemEC轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRTPCR法檢測(cè)HemEC中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量，方法同1.3.1。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)HemEC增殖能力 以CCK-8底物反應(yīng)后的光密度測(cè)定細(xì)胞活力，即在待測(cè)的每孔細(xì)胞中加入10 μl CCK-8溶液，置于37℃下孵育2 h，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔細(xì)胞的吸光度值。以EdU免疫熒光強(qiáng)度測(cè)定細(xì)胞增殖，具體操作步驟參考EdU增殖檢測(cè)使用說(shuō)明書，制備EdU培養(yǎng)基，離心重懸并收集待測(cè)細(xì)胞，以加入1×Apollo染液500 μl避光染色10 min，磷酸鹽緩沖液清洗后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度，相對(duì)熒光強(qiáng)度越高表示增殖能力越強(qiáng)。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HemEC侵襲和遷移能力將Transwell上室濾膜經(jīng)人工基底膜涂覆，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h待用，將待檢測(cè)的HemEC用胰蛋白酶消化，離心后采用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液，取出平衡后的Transwell小室，于下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基600 μl，于上室加入細(xì)胞懸液200 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室，擦去上室細(xì)胞及細(xì)胞碎片，加入結(jié)晶紫溶液500 μl進(jìn)行染色，清洗后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察并拍照，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。檢測(cè)細(xì)胞遷移能力時(shí)，Transwell上室濾膜未經(jīng)人工基底膜涂覆，其余步驟同Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞中VEGFR2的表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染后48 h各組Hem-EC，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取細(xì)胞中蛋白，采用蛋白質(zhì)定量檢測(cè)（BradfordProteinAssay，BAC）法定量檢測(cè)提取的蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離蛋白，將凝膠蛋白低溫下轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，分別加入一抗VEGFR2（1∶800稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，再加入1∶1000稀釋的二抗，室溫反應(yīng)2 h。以HRP催化電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算細(xì)胞中VEGFR2蛋白的表達(dá)水平。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過(guò)生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00152與miRNA-200c-5p和miRNA-195-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，分別擴(kuò)增 LINC00152與 miRNA-200c-5p和miRNA-195-5p結(jié)合位點(diǎn)序列，分別構(gòu)建到報(bào)告基因載體上，記為L(zhǎng)inc-WT報(bào)告質(zhì)粒，同時(shí)將LINC00152與miRNA-200c-5p和miRNA-195-5p結(jié)合位點(diǎn)紊亂序列構(gòu)建到報(bào)告基因載體上，記為L(zhǎng)inc-MUT報(bào)告質(zhì)粒，按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞10 min，離心后取上清，加入50 μl熒光素酶檢測(cè)試劑，振蕩混勻10 min，分別測(cè)定雙熒光素酶活性，根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算各組織細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或SNK-q檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)，每組數(shù)據(jù)代表6個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 LINC00152在不同組織中的相對(duì)表達(dá)情況

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LINC00152在血管瘤增生期組織和血管瘤退化期組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.91±0.28）、（3.20±0.66），均明顯高于癌旁正常皮膚組織的（1.00±0.17），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.614、6.344，P＜0.01）。LINC00152在血管瘤退化期組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于血管瘤增生期組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.729，P＜0.01）。

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量

NC組、sh-NC組和OE-NC組細(xì)胞中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與sh-NC組相比，sh-Linc1組和sh-Linc2組細(xì)胞中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.572、2.912，P＜0.05）。與OE-NC組相比，OE-Linc1組和OE-Linc2組細(xì)胞中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.619、6.648，P＜0.01）。（圖1）

圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中LINC00152的相對(duì)表達(dá)量

2.3 過(guò)表達(dá)或敲低LINC00152對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低LINC00152后，NC組、sh-NC組、sh-Linc1組和sh-Linc2組的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（1.00±0.16）、（0.94±0.14）、（0.60±0.11）、（0.56±0.10）。NC組和sh-NC組的相對(duì)熒光強(qiáng)度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。sh-Linc1組和sh-Linc2組的相對(duì)熒光強(qiáng)度均明顯低于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.823、P=0.005；t=4.197、P=0.003）。過(guò)表達(dá)LINC00152后，NC組、OE-NC組、OE-Linc1組和OE-Linc2組的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（1.00±0.16）、（0.95±0.16）、（1.68±0.25）、（1.63±0.24）。NC組和OE-NC組的相對(duì)熒光強(qiáng)度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。OELinc1組和OE-Linc2組的相對(duì)熒光強(qiáng)度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 過(guò)表達(dá)或敲低LINC00152對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

NC組、OE-NC組和sh-NC組細(xì)胞的侵襲比例和細(xì)胞遷移比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。OE-Linc1組和OE-Linc2組細(xì)胞的侵襲比例均明顯高于OE-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.573、3.736，P＜0.01）；OE-Linc1組和OE-Linc2組細(xì)胞的遷移比例均明顯高于OE-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.067、3.742，P＜0.01）。（圖2）

2.5 LINC00152與miRNA-200c-5p、miRNA-195-5p間的相互作用

圖2 過(guò)表達(dá)或敲低LINC00152對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)LINC00152靶向結(jié)合位點(diǎn)，LINC00152能夠與miRNA-200c-5p和miRNA-195-5p靶向結(jié)合（圖3）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，Linc-WT報(bào)告質(zhì)粒組中miRNA-200c-5p mimic-NC、miRNA-200c-5p mimic、miRNA-195-5p mimic-NC、miRNA-195-5p mimic的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（1.00±0.15）、（0.20±0.03）、（1.00±0.15）、（0.25±0.04），與mimic-NC相比，miRNA-200c-5p或miRNA-195-5p mimic共轉(zhuǎn)染可明顯降低報(bào)告質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶活性（P＜0.01），而報(bào)告質(zhì)粒Linc-MUT中 miRNA-200c-5p mimic-NC、miRNA-200c-5p mimic、miRNA-195-5p mimic-NC、miRNA-195-5p mimic的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（1.00±0.15）、（1.05±0.15）、（1.00±0.15）、（0.96±0.14）；與mimic-NC相比，miRNA-200c-5p或miRNA-195-5p mimic共轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。

圖3 LINC00152與miRNA-200c-5p和miRNA-195-5p間結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果示意圖

2.6 過(guò)表達(dá)或敲低LINC00152對(duì)VEGFR2表達(dá)的影響

VEGFR2mRNA在正常組織、血管瘤增生期組織和退化期組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.16）、（1.30±0.19）、（1.13±0.17）。與癌旁正常皮膚組織相比，血管瘤增生期組織中VEGFR2mRNA的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與血管瘤增生期組織相比，血管瘤退化期組織中VEGFR2mRNA的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，OE-NC和sh-NC組細(xì)胞中VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與OE-NC組相比，OE-Linc1組和OE-Linc2組細(xì)胞中VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與sh-NC組相比，sh-Linc1組和sh-Linc2組細(xì)胞中VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 敲低或過(guò)表達(dá)LINC00152后Hem-EC中VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較（x±s）

OE-Linc1中，與mimic NC組相比，miRNA-200c-5p組、OE-Linc1 miRNA-16-5p組和OE-Linc1 miRNA-195-5p組細(xì)胞中VEGFR2蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（t=4.672、4.964、4.745，P＜0.01）。sh-Linc2中，與inhibitor NC組相比，miRNA-200c-5p組、sh-Linc2 miRNA-16-5p組和sh-Linc2 miRNA-195-5p組細(xì)胞中VEGFR2蛋白的表達(dá)水平均明顯升高（t=4.375、3.914、3.799，P＜0.01）。（圖4）

圖4 LINC00152與miRNA-200c-5p、miRNA-195-5p和miRNA-16-5p間的相互作用

2.7 LINC00152通過(guò)VEGFR2促進(jìn)HemEC的活性

與NC組相比，miRNA-200c-5p組、miRNA-195-5p組和SKLB1002組細(xì)胞在72 h時(shí)的光密度值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.430、3.563、5.874，P＜0.05）。（圖5）

圖5 不同組別HemEC細(xì)胞的光密度值

2.8 LINC00152通過(guò)VEGFR2影響HemEC的侵襲和遷移

與NC組相比，miRNA-200c-5p組、miRNA-195-5p組和SKLB1002組HemEC在體外的遷移能力均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.939、3.589、5.558，P＜0.01）；與 NC 組相比，miRNA-200c-5p組、miRNA-195-5p組和SKLB1002組Hem-EC在體外的侵襲能力均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.736、4.208、5.894，P＜0.01）。（表2）

表2 不同組別HemEC在體外侵襲和遷移能力的比較（±s）

表2 不同組別HemEC在體外侵襲和遷移能力的比較（±s）

注：*與NC組比較，P＜0.01

組別NC組miRNA-200c-5p組miRNA-195-5p組SKLB1002組細(xì)胞遷移1.00±0.17 0.62±0.11*0.65±0.11*0.46±0.06*細(xì)胞侵襲1.00±0.16 0.59±0.09*0.63±0.10*0.49±0.07*

3 討論

血管瘤常發(fā)生于嬰幼兒的頭頸部皮膚及皮下組織，大部分血管瘤可自行消退，但是大面積的血管瘤消退后可后遺淺瘢痕、局部色素沉淀、皮膚萎縮下垂等體征。血管瘤的病理學(xué)特點(diǎn)是HemEC增殖活躍，并伴有血管生成和肥大細(xì)胞的聚集。VEGFR2是蛋白酪氨酸激酶家族成員之一，具有蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）結(jié)構(gòu)域，可與VEGF結(jié)合激活PTK的活性，通過(guò)磷酸化下游分子激活相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為[15]。在胃癌細(xì)胞中，VEGFR2可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA在肺癌細(xì)胞Calu-1中敲低VEGFR2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯受到抑制；此外，下調(diào)VEGFR2的表達(dá)還可提高放射后肺癌細(xì)胞的凋亡率[17]。研究表明，血管瘤細(xì)胞可以自分泌的形式分泌VEGF-A并激活自身的VEGFR2，導(dǎo)致細(xì)胞的存活、增殖和遷移能力提高[18]。本研究結(jié)果顯示，LINC00152在血管瘤增生期組織和血管瘤退化期組織中的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于癌旁正常皮膚組織（P＜0.01），提示VEGFR2可能促進(jìn)血管瘤的生長(zhǎng)。

最近的研究指出lincRNA可調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG16可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-520d-3p降低后者對(duì)STAT3基因表達(dá)的靶向抑制能力，提高HemEC的增殖、遷移和侵襲能力。此前Liu等[20]通過(guò)微陣列比較了新生兒血管瘤病理組織和癌旁組織中mRNA及l(fā)ncRNA的差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FENDRR、MEG3、MEG8、LINC00152和H19等lncRNA在血管瘤中的表達(dá)量均升高。此外有研究表明，LINC00152可促進(jìn)多種腫瘤的進(jìn)展[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC00152敲低可抑制HemEC的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)HemEC的凋亡，過(guò)表達(dá)LINC00152則促進(jìn)HemEC的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲，正常腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的凋亡率為5%，過(guò)表達(dá)LINC00152細(xì)胞的凋亡率降低不明顯，因此本實(shí)驗(yàn)未展示此組數(shù)據(jù)。通過(guò)LINC00152在血管瘤組織中的表達(dá)情況可知，LINC00152可促進(jìn)血管瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，與上述報(bào)道相符。

LINC00152被鑒定為涉及多種惡性腫瘤的癌基因，例如胃癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、膽囊癌和腎細(xì)胞癌。LINC00152促癌的機(jī)制多為其作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA與特定的miRNA相結(jié)合，解除miRNA對(duì)相關(guān)原癌和促癌基因表達(dá)的抑制作用[23-24]。Chen等[25]首次報(bào)道了LINC00152與miRNA-16-5p間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00152可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-16-5p促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)合Li等[7]的研究，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選出LINC00152與miRNA-200c-5p、miRNA-195-5p和miRNA-16-5p結(jié)合的作用靶點(diǎn)，其中，已有LINC00152與miRNA16-5p相結(jié)合的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)不再重復(fù)驗(yàn)證，而是通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了LINC00152與miRNA-200c-5p、miRNA-195-5p相互結(jié)合的作用。敲低或過(guò)表達(dá)LINC00152可影響miRNA的表達(dá)，miRNA過(guò)表達(dá)對(duì)LINC00152的表達(dá)也產(chǎn)生影響。此外，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了敲低或過(guò)表達(dá)LINC00152對(duì)VEGFR2轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的影響。過(guò)表達(dá)miRNA-200c-5p或miRNA-195-5p能夠回調(diào)由LINC00152過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的VEGFR2表達(dá)量升高。以上結(jié)果表明，LINC00152可競(jìng)爭(zhēng)性地與miRNA-200c-5p、miRNA-195-5p和miRNA-16-5p結(jié)合，提高VEGFR2的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制VEGFR2的表達(dá)可降低由過(guò)表達(dá)LINC00152誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；miRNA-200c-5p和miRNA-195-5p對(duì)應(yīng)的agomir處理模擬miRNA的過(guò)表達(dá)，同樣可降低由過(guò)表達(dá)LINC00152誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明LINC00152通過(guò)VEGFR2促進(jìn)HemEC的存活、遷移和侵襲。

綜述所述，LINC00152可提高 VEGFR2在HemEC中的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)HemEC的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與LINC00152與 miRNA-200c-5p、miRNA-195-5p和miRNA-16-5p間的結(jié)合導(dǎo)致VEGFR2表達(dá)水平升高有關(guān)，證明了LINC00152促進(jìn)血管瘤發(fā)生、發(fā)展的效果，抑制LINC00152的表達(dá)可能對(duì)血管瘤或其他腫瘤的治療具有潛在的意義，為L(zhǎng)INC00152可能作為血管瘤的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物提供一定的理論基礎(chǔ)。