汪良峰，陳海英，俞建峰，崔政偉

（江南大學(xué) 江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

關(guān)鍵字：蒸汽；鮮榨蘋果漿；褐變；抗氧化性；風(fēng)味物質(zhì)

中國(guó)是世界上蘋果第一生產(chǎn)大國(guó)，總產(chǎn)量已超過世界總產(chǎn)量的55%[1]。如此龐大的產(chǎn)量已遠(yuǎn)超鮮銷市場(chǎng)的需求，蘋果深加工已然迫在眉睫。我國(guó)蘋果汁加工產(chǎn)業(yè)起步晚，年加工用果僅占蘋果總產(chǎn)量20%，而歐美國(guó)家已經(jīng)達(dá)到50%以上[2]。

褐變一直是制約國(guó)際蘋果汁行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵難題。褐變是指蘋果在制漿后顏色呈褐色以及在貯藏中褐色加深的現(xiàn)象[3]。褐變不僅影響蘋果漿的外觀、口感和風(fēng)味，還造成營(yíng)養(yǎng)成分的流失，降低果漿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值。

近年來有很多學(xué)者做了關(guān)于蘋果汁防褐變的研究，如李敏等采用添加樹脂、活性炭等措施控制蘋果汁顏色加深[4-5]，Thada等添加豆香素等植物提取物防止蘋果汁酶促褐變[6-7]，Riahi等采用超高壓滅酶防止酶促褐變[8-9]，但同時(shí)也產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，生產(chǎn)成本高，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等問題。蒸汽處理能防止鮮榨蘋果漿褐變，同時(shí)工序簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。作者用自行設(shè)計(jì)、搭建的試驗(yàn)裝置，實(shí)現(xiàn)破碎制漿和蒸汽滅酶工藝耦合，探討蒸汽環(huán)境制漿對(duì)果漿色澤、理化性質(zhì)、抗氧化性、風(fēng)味物質(zhì)保留的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果：市售，選取大小均勻、顏色相近的蘋果，貯藏于4℃?zhèn)溆?；仲辛醇、沒食子酸、自由基產(chǎn)生劑偶氮二異丁脒鹽酸鹽 （AAPH）、熒光物質(zhì)Sodium Fluorescein：阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

LDR24-0.45-Z全自動(dòng)小型電加熱蒸汽鍋爐：順達(dá)服裝機(jī)械有限公司產(chǎn)品；TM-767II多功能果蔬破碎機(jī)：海盤電器有限公司產(chǎn)品；UPLC-TQD超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)waters公司產(chǎn)品；UltraScan Pro1166高精度分光測(cè)色儀：美國(guó)Hunter lab公司產(chǎn)品；PowerWave XS2酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio Tek公司產(chǎn)品；TGL-16C高速離心機(jī)：安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；UV1800紫外可見光分光光度計(jì)：日本島津公司產(chǎn)品；LZB-10WB玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)：祥云流量?jī)x器廠產(chǎn)品；PHS-4CT型智能臺(tái)式pH計(jì)：康儀儀器有限公司產(chǎn)品；PAL-1手持?jǐn)?shù)顯糖度計(jì)：日本愛拓公司產(chǎn)品；CENTER-309溫度計(jì)：群特科技股份有限公司產(chǎn)品；AR1140分析天平：美國(guó)奧斯豪儀器有限公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)圖如圖1所示。

圖1 自制蒸汽滅酶與破碎制漿耦合實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)圖Fig.1 Sketch for self-designed equipment of coupling steam inactive enzyme and break pulp

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前將蘋果從冷藏柜中取出，置于25℃水浴中1 h后，去皮、去核、切塊，每份100 g，然后裝入果蔬破碎機(jī)中待打漿處理。通過打漿前和打漿過程中持續(xù)向破碎腔中通入適當(dāng)蒸汽實(shí)現(xiàn)蒸汽滅酶和破碎制漿耦合，試驗(yàn)裝置如圖1。前期多次嘗試性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)通入壓強(qiáng)0.13 MPa、溫度107℃的1 750 L/h高溫蒸汽 （以下高溫蒸汽的條件均相同）100 s時(shí)，果漿溫度已經(jīng)達(dá)到95℃；而通入750 L/h蒸汽50 s時(shí)，果漿褐變依然很明顯。作者研究方案為蒸汽流量取 1 000、1 250、1 500、1 750 L/h， 通入蒸汽時(shí)間取 50、60、70、80、90 s。 每組試驗(yàn)做 3 個(gè)平行，記錄色值和打漿結(jié)束時(shí)果漿溫度。

1.3.1 蘋果漿色澤測(cè)定 鮮榨果漿自然冷卻10 min中后用hunter lab高精度分光測(cè)色儀進(jìn)行色澤測(cè)定。 白板校準(zhǔn)值為：L0=93.5、a0=-0.84、b0=0.66；L表示明度L=0指示黑色L=100指示白色。

1.3.2 蘋果漿PPO活性測(cè)定 參考Krapfenbauer等[10]的方法，略有改動(dòng)。取10 mL鮮榨果漿與20 mL 4 g/dL PVPP充分混合后在12 000 r/min離心20 min后取上清液，即為PPO粗酶液。比色皿中加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液 （pH 6.5），30 s后加入0.5 mL粗酶液，30 s后再加入1 mL鄰苯二酚 （0.2 mol/L），混合均勻后立刻在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，連續(xù)測(cè)定2 min。酶活性（U）由開始處反應(yīng)速率決定。作者通過蒸汽環(huán)境打漿與常溫（25℃）打漿的對(duì)比，來探究破碎制漿耦合蒸汽滅酶對(duì)鮮榨果汁的影響，故用實(shí)測(cè)果漿PPO活性與果漿25PPO活性做比，得到相對(duì)活性R，計(jì)算式：

式中：U為蒸汽環(huán)境打漿的果漿PPO活性，U25為對(duì)照果漿25PPO活性。

1.3.3 蘋果漿總酸測(cè)定 參考GB/T 12456—2008食品中總酸的測(cè)定。

1.3.4 蘋果漿總酚測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法[11]，略有改動(dòng)。鮮榨蘋果漿稀釋10倍，過濾，取1 mL濾液于試管中，加入2.5 mL福林—酚試劑，混合均勻后加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的Na2CO3溶液，在45℃水浴中反應(yīng)1.5 h后，在756 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。用沒食子酸制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 蘋果漿總糖測(cè)定 參考 Zhao等方法[12]。取20 g鮮榨果漿與10 mL鹽酸（體積分?jǐn)?shù)10%）充分混合后加入80 mL去蒸餾水水，過濾后留濾液備用。具塞試管加入2 mL備用濾液后立即加入8 mL蒽酮試劑 （0.2 g蒽酮溶于100 mL濃硫酸，現(xiàn)配限用），在100沸水浴中加熱10 min，冰浴冷卻室溫后在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)量吸光值。用葡萄糖溶液制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 蘋果漿抗氧化性測(cè)定 參考徐維盛等方法[13]。取10 g果漿與20 g乙醇（體積分?jǐn)?shù)50%）混合均勻后，12 000 r/min離心20 min，取上清液，即為待測(cè)樣品溶液。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制適當(dāng)濃度的熒光素鈉鹽、AAPH溶液。在96孔黑色熒光酶標(biāo)儀板各孔加入25 μL樣品溶液后，用自動(dòng)加樣器向各微孔中添加濃度為0.159 μmol/L的熒光素鈉鹽75 μL；37孵育10 min后，用自動(dòng)加樣器加入濃度38.25 mmol/L的AAPH溶液100 μL。以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)，每70 s測(cè)定一次熒光強(qiáng)度，持續(xù)4200 s，整個(gè)體系維持37℃。試驗(yàn)所得不同時(shí)間熒光強(qiáng)度與初始時(shí)間熒光強(qiáng)度相比，折算成相對(duì)熒光強(qiáng)度f，采用近似積分計(jì)算出熒光衰退曲線下方面積（AUC），如式：

式中，fn為第n個(gè)測(cè)定點(diǎn)相對(duì)熒光強(qiáng)度；Δt為相鄰兩測(cè)定點(diǎn)時(shí)間間隔，70 s。

計(jì)算樣品AUC與僅有APPH作用下的AUC之差得到凈AUC，用樣品net AUC來表征蒸汽對(duì)3種蘋果漿抗氧化活性的影響。

1.3.7 蘋果漿風(fēng)味測(cè)定 采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)蘋果漿風(fēng)味物質(zhì)成分及含量測(cè)定[14]。取2 g樣品和3 mL蒸餾水置于20 mL樣品瓶中，加入2 g促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)的NaCl，用 2 μL 1.6 mg/mL的2-辛醇作內(nèi)標(biāo)，之后在40℃加熱平衡臺(tái)上平衡10 min。萃取頭插入250℃的GC進(jìn)樣口老化30 min后插入已平衡好的樣品瓶中吸附，再插入GC進(jìn)樣口解吸。氣相色譜條件：Agilent HP-5毛細(xì)管柱，氦載氣流量1 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流；升溫程序?yàn)?，起始柱?5℃，維持1 min以后以1℃/min速率增加至70℃，維持2 min，再以5℃/min速率升溫至230℃，維持5 min。質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，采用電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，電子能量70 eV，捕獲方式為全掃描（m/z30～600）。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒸汽對(duì)鮮榨蘋果漿褐變影響

從圖2中可以看出，打漿結(jié)束時(shí)果漿溫度和蒸汽處理時(shí)間基本呈正向線性關(guān)系，而L值這種變化趨勢(shì)并不明顯。圖2（b）中，在蒸汽流量低于1 250 L/h，蒸汽時(shí)間小于80 s時(shí)，果漿顏色相對(duì)較深，和未蒸汽處理的對(duì)照組相差不大。在蒸汽流速大于1 500 L/h、蒸汽時(shí)間大于60 s時(shí)鮮榨果漿L值較大；并且在蒸汽時(shí)間超過70 s后，隨著蒸汽時(shí)間增加L值變化平緩。圖2（b）中，在縱坐標(biāo)L值為50左右（L*）畫條橫線（分界線），發(fā)現(xiàn)在分界線以下的試驗(yàn)點(diǎn)（褐變?cè)囼?yàn)點(diǎn)）偏離分界線均比較遠(yuǎn)。說明這些褐變?cè)囼?yàn)點(diǎn)在打漿結(jié)束后10 min內(nèi)顏色變化很快、幅度大。鮮榨果漿破碎時(shí)顏色變化主要由酶促褐變產(chǎn)生[15]，由此可以推測(cè)這些褐變?cè)囼?yàn)點(diǎn)在打漿結(jié)束后10 min內(nèi)發(fā)生了劇烈的酶促褐變反應(yīng)。在分界線以上的試驗(yàn)點(diǎn)（有效試驗(yàn)點(diǎn)）離分界線均相對(duì)較近，且變化平緩，說明有效試驗(yàn)點(diǎn)L值在超過L*后變化很??；此時(shí)果漿色澤明亮、穩(wěn)定，酶活性較弱。溫度是影響酶活力的最主要因素，在圖2（a）中以褐變?cè)囼?yàn)點(diǎn)為參考畫出一條直線。這條直線代表的溫度（T*=80℃左右）表示為本實(shí)驗(yàn)方案下酶有效失活溫度。

在圖2（a）中有部分試驗(yàn)點(diǎn)雖然果漿L值大、褐變程度小，但打漿結(jié)束溫度已經(jīng)超過95℃，已經(jīng)嚴(yán)重影響到果漿的品質(zhì)[16]。結(jié)合果漿褐變程度，在打漿結(jié)束時(shí)溫度 25℃、70～80℃、80～90℃、90～100℃ 4個(gè)階段分別取一個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。4個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)參數(shù)如表1。

圖2 不同蒸汽處理對(duì)鮮榨果漿溫度和L值影響Fig.2 Effect of steam treatment on temperature and Lvalue of fresh apple juice

表1 4個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)參數(shù)Table 1 Parameters of four test point

2.2 蒸汽對(duì)鮮榨蘋果漿PPO活性影響

由圖3可以看出打漿結(jié)束時(shí)溫度在80℃以上的P3、P4試驗(yàn)點(diǎn)酶活性很低，僅有對(duì)照P1試驗(yàn)點(diǎn)10%左右；P2試驗(yàn)點(diǎn)雖然溫度也達(dá)到了73℃，依然有66%的活性。這個(gè)現(xiàn)象與上文中蒸汽環(huán)境打漿果漿PPO活性在T*有臨界點(diǎn)的推測(cè)相符合。從圖4中4個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)打出果漿10 min后拍照?qǐng)D，很清楚的看出蒸汽環(huán)境打漿結(jié)束時(shí)溫度高于T*的P3、P4試驗(yàn)點(diǎn)，果漿中PPO活性基本得到鈍化，酶促褐變基本得到抑制。

圖3 4個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)果漿溫度及果漿相對(duì)酶活性Fig.3 Pulp temperature and relative enzyme activity of four test points apple juice

圖4 4個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)打出果漿10 min后拍照?qǐng)DFig.4 Photo graph for four test points apple juice after 10 min of breaking

2.3 蒸汽對(duì)鮮榨蘋果漿理化性質(zhì)影響

結(jié)合2.1、2.2結(jié)論選擇了試驗(yàn)點(diǎn)P4、P3以及對(duì)照組P1進(jìn)行后續(xù)分析試驗(yàn)，并把制的果漿以打漿結(jié)束時(shí)果漿溫度分別命名為：果漿93（打漿結(jié)束時(shí)果溫度93℃，以下類同）、果漿83、果漿25。

3種果漿部分理化性質(zhì)如表2所示。果漿83、果漿93總酚含量比果漿25要高很多，這和文獻(xiàn)[17]試驗(yàn)結(jié)果相一致。酚類是果漿中很重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一，酶促褐變的有效抑制極大的提高了果漿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?？偹岬脑黾?、pH降低和文獻(xiàn)略有不同[18]，其中機(jī)理也尚不清楚，酸性物質(zhì)的增加對(duì)改善蘋果漿酸甜可口的口感有很大幫助。果漿83、果漿93總糖含量明顯比果漿25要低，而且果漿83也比果漿93要高；這應(yīng)該是由蒸汽環(huán)境打漿隨著溫度的升高加劇了糖類焦化反應(yīng)導(dǎo)致的。由此可以看出，在蒸汽環(huán)境中打漿雖然糖類有所流失，有利于酚類和酸性物質(zhì)的保留。

表2 蒸汽處理對(duì)果漿理化特性影響Table 2 Effect of steam treatment on physical and chemical properties of apple juice

2.4 蒸汽處理對(duì)抗氧化性影響

氧自由基吸收能力能很好的表征蘋果漿抗氧化活性。3種果漿熒光衰減情況如圖5所示，果漿25熒光衰減速度明顯比果漿83、果漿93要快很多；3種果漿凈 AUC分別為 1555.694、3196.466、3738.196，從中可以看出果漿83、果漿93在氧自由基吸收能力上比果漿25要好很多，說明蒸汽環(huán)境打漿增加了果漿的抗氧化性。這和蒸汽環(huán)境打漿有效抑制了酶促褐變，保留果漿中酚類、黃酮類化合物有關(guān)[19]。果漿93的抗氧化性比果漿83要好，說明果漿抗氧化性增加依賴于打漿結(jié)束時(shí)溫度的升高；適當(dāng)提高打漿結(jié)束時(shí)溫度更有利于抗氧化性增加，但也不可避免的帶來其他影響。

圖5 3種果漿熒光衰減圖Fig.5 Fluorescence decay of three apple juice

2.5 蒸汽對(duì)鮮榨蘋果漿風(fēng)味影響

采用頂空固相微萃取氣—質(zhì)聯(lián)用技術(shù)從3種鮮榨果漿中檢測(cè)出大約230種物質(zhì)，其中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.1%）有45種，如表3所示。主要風(fēng)味物質(zhì)有醇類、酯類、醛類、酮類、烯烷炔，其中醇類和酯類種類最多，分別有12種、10種。3種果漿檢測(cè)出的化合物種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖6所示，從中可以看出果漿中揮發(fā)性風(fēng)物物質(zhì)種類雖然很多，但相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.1%化合物（C類化合物）種類卻很少，僅占所有物質(zhì)種類16%左右。果漿83、果漿93中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類比果漿25增加了30種左右，這應(yīng)該和蒸汽環(huán)境打漿果膠酶將半乳糖醛酸分解為小分子的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)[20]。C類化合物含量總和在通入蒸汽后變化非常明顯，在沒有通入蒸汽的果漿25中達(dá)到50.37%，而通入蒸汽后的果漿93、果漿83中分別僅有22.44%、19.25%。通入蒸汽后，C類化合物含量的降低可能由兩部分造成：一部分是低沸點(diǎn)風(fēng)味物質(zhì)在高溫打漿環(huán)境中提前揮發(fā)；另一部分是高溫致使一些風(fēng)味物質(zhì)分解。

表3 3種果漿中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 3 Main volatile flavor compounds of apple juice

續(xù)表3

圖6 3種果漿檢測(cè)出的化合物種數(shù)及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.6 Number of compounds detected and relativecontent of apple juice

按化合物種類和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)C類化合物進(jìn)行了分類分析，結(jié)果如表4。果漿93、果漿83與果漿25相比醇類、醛類、酮類的物質(zhì)種類沒有明顯的變化，酯類、烯烷炔變化明顯，其中酯類物質(zhì)種類減少了100%左右。5類物質(zhì)在相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)上均有明顯變化，尤其是醛類變化最大，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了90%以上，醇類、酯類、分別降低了50%、70%左右，酮類質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然有所增加，但相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低僅有0.5%左右。

表4 3種果漿中幾種主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種數(shù)和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 Species and relative content of several kinds of main volatile flavor compounds of apple juice

蒸汽處理對(duì)果漿中揮發(fā)性風(fēng)味影響明顯，通入蒸汽后雖然化合物種類略有增加，但影響果漿風(fēng)味最大的3類物質(zhì)，醇類、酯類、醛類損失較多，并且打漿結(jié)束時(shí)溫度越高，損失越明顯。

3 結(jié) 語(yǔ)

通過采用小型蒸汽滅酶與破碎制漿耦合實(shí)驗(yàn)裝置在蒸汽環(huán)境對(duì)蘋果破碎進(jìn)行打漿試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)合適的蒸汽處理可以抑制果漿的酶促褐變，改善果漿色澤；果漿PPO在打漿結(jié)束溫度80℃以上基本失活。進(jìn)一步對(duì)果漿93、果漿83和果漿25進(jìn)行了理化性質(zhì)、抗氧化性、風(fēng)味物質(zhì)的比較分析。發(fā)現(xiàn)蒸汽環(huán)境打漿由于有效的抑制了酶促褐變，改善了果漿理化性質(zhì)，同時(shí)極大的保留了果漿的抗氧化活性；同時(shí)由于蒸汽的通入升高了果漿溫度，損失了果漿中風(fēng)味物質(zhì)，并且這種損失隨著打漿結(jié)束時(shí)溫度的升高而增加。蒸汽環(huán)境中打漿，通過合理控制蒸汽用量可以達(dá)到，滅酶防褐變，改善果漿品質(zhì)的效果。

蒸汽環(huán)境打漿工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，目前作者正在研制成熟的適合大規(guī)模生產(chǎn)的蘋果蒸汽破碎機(jī)。