王洪杰， 鄔應(yīng)龍*，馮莉梅，楊 敏，鄭俏然，嚴(yán)秋萍，呂珍珍， 何 梅

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.長江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶408100）

氧化魔芋葡甘露聚糖 （Oxidized konjac glucomannan，OKGM）是由魔芋葡甘露聚糖（KGM）經(jīng)適當(dāng)?shù)难趸瘎┨幚斫到夂缶贫傻男再|(zhì)優(yōu)良的可溶性膳食纖維，具有安全性高、成本低等特點(diǎn)，能促進(jìn)正常和免疫低下動物免疫器官的發(fā)育，提高機(jī)體免疫力[1]。研究表明，OKGM在預(yù)防和治療腸道癌、心血管病、提高免疫力方面發(fā)揮重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖硫酸化可改善其生物活性，且多糖的生物活性與硫酸化取代度相關(guān)[3]。氧化魔芋葡甘露聚糖硫酸酯 （Oxidized konjac glucomannan sulfates，OKGMS）是由OKGM經(jīng)磺化劑化學(xué)修飾而得到的產(chǎn)物，研究表明，多糖硫酸酯具有抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功能[4]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，OKGMS比活菌制劑性質(zhì)更穩(wěn)定，對外界環(huán)境及機(jī)體內(nèi)環(huán)境具有較高的耐受性，能更好地發(fā)揮其功效[5]。

齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）屬鯉形目，鯉科魚類，主要分布于長江上游、大渡河、青衣江及漢江的上游。齊口裂腹魚是一種冷水性經(jīng)濟(jì)魚類，味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值[6]。近年來，隨著齊口裂腹魚的人工繁殖技術(shù)的提高，逐步開始了大規(guī)模養(yǎng)殖，但齊口裂腹魚為低等脊椎動物，不具備成熟的特異性免疫系統(tǒng)而主要依靠先天性免疫，對環(huán)境的適應(yīng)能力較差[7]。

目前，已有研究表明日糧添加一定量OKGM能提高魚類免疫性能[8]，但添加劑量有待進(jìn)一步研究，而OKGMS相關(guān)研究主要集中在體外抗腫瘤[9]、抗氧化[10]等方面，在魚類體內(nèi)的研究還未見報道。作者以O(shè)KGM和OKGMS為試驗材料，以齊口裂腹魚為研究對象，探討飼喂不同劑量OKGM及OKGMS對齊口裂腹魚體血清免疫及抗氧化指標(biāo)的影響，并通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測齊口裂腹魚免疫相關(guān)基因髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）、干擾素影響因子 7（Interferon regulator factor 7，IRF7）在腸道、肝臟、脾臟、頭腎、中腎中的相對表達(dá)量，以期為今后OKGM和OKGMS在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

齊口裂腹魚購買于四川省雅安市天泉縣魚泉鄉(xiāng)雅魚場同一批孵化的魚種，質(zhì)量為 （80.37±5）g/尾；OKGM實驗室自制，黏均相對分子質(zhì)量9.8×103；OKGMS實驗室自制，黏均分子量1.6×105，取代度1.44；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：TaKaRa公司產(chǎn)品；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；魚總補(bǔ)體（ACH50）、魚免疫球蛋白M（IgM）試劑盒：上海雅吉生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖：Spain公司產(chǎn)品；熒光定量八連板 ：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；PCR儀器：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；微量移液器：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；水平電泳槽、電泳儀：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀器：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；Centrifuge 5810R高速低溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗飼料配方及飼養(yǎng) 參照魚類營養(yǎng)需要和Zheng等[11]齊口裂腹魚飼料配方設(shè)計試驗飼料，配方見表1，試驗飼料充分混合后加工成直徑1 mm的顆粒飼料，干燥并密封保存于4℃冰箱下備用。

1.3.2 飼養(yǎng)管理 選擇體質(zhì)健康的齊口裂腹魚420尾，按試驗設(shè)計分為7個組，每組60尾，分為3個重復(fù)，每天投喂魚體質(zhì)量2.0%的飼料，早中晚各一次。

1.3.3 取樣 飼養(yǎng)60 d后進(jìn)行采樣，采樣前禁食24 h并稱重。從尾靜脈取血，血液于4℃條件下靜置30 min，3 500 r/min 4℃離心15 min取上清液，放置于-20℃冰箱備用；取血后迅速取出肝臟、脾臟、頭腎、中腎、腸道，用密封袋裝樣后放入液氮中迅速降溫，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。研磨樣品時向研缽內(nèi)不斷補(bǔ)充液氮以保持樣品處于低溫狀態(tài)防止RNA降解，待樣品磨成粉末狀，用耳勺取適量至編好號的離心管中，并立即置于液氮中，樣品全部取完后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血清免疫及抗氧化指標(biāo)測定 按照試劑盒說明書測定血清中免疫球蛋白 （IgM）、總補(bǔ)體（ACH50 ）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）指標(biāo)。

1.3.5 總RNA提取和cDNA模板制備 按照TRNzol總RNA提取試劑盒說明書提取腸道、肝臟、脾臟、頭腎、中腎RNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測提取產(chǎn)物的完整性，并用核酸蛋白定量儀檢測RNA純度。A260/A280介于1.8～2.2之間時，說明提取的RNA質(zhì)量合格，可用于后續(xù)試驗。RNA檢測合格后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于熒光定量測定基因相對表達(dá)量。

1.3.6 引物設(shè)計及鑒定 齊口裂腹魚β-actin基因引物由實驗室提供，MyD88基因及IRF7基因參照NCBI斑馬魚、草魚、鯉魚序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由華大基因公司合成，引物序列如表2所示。

1.3.7 熒光定量 采用 10 μL反應(yīng)體系 （3.5 μL DEPC 水、5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）、1 μL cDNA、0.25 μL上下游引物）將反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95℃，3 min；95℃，10 s，不同引物相應(yīng)退火溫度，30 s，39個循環(huán)；擴(kuò)增完畢后，迅速降溫到65℃進(jìn)行熔解曲線分析，然后以0.5℃/s的速率從65℃遞增至95℃，連續(xù)測定樣品熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線。

表1 試驗飼料的組成Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diets（dry matter）

表2 PCR引物序列Table 2 Sequences of primers for PCR

1.3.8 基因序列分析及分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建 用1.0%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性及特異性，若有和目的片段大小一致的單一明亮條帶，回收PCR產(chǎn)物送至華大基因測序，同一樣品測序2次。測得基因序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接和分析，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用循環(huán)閾值 （Cycle threshold，Ct）法比較各組織中目的基因mRNA的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因來彌補(bǔ)組織之間的差異。所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 兩種多糖對齊口裂腹魚血清免疫及抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，OKGMS1.6組能顯著提高齊口裂腹魚血清IgM活性、ACH50質(zhì)量分?jǐn)?shù) （P＜0.05），其他劑量組均可提高血清IgM質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但未達(dá)到顯著水平；OKGMS0.4、OKGMS0.8、OKGM0.4、OKGM0.8組均能顯著降低血清MDA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（P＜0.05），說明這兩種多糖對血清MDA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的影響。OKGMS與OKGM均能提高血清SOD活性，且OKGMS各劑量組均達(dá)到顯著水平。

表3 OKGM與OKGMS對齊口裂腹魚血清免疫及抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of OKGM and OKGMS on serum immune and antioxidant index of Schizothorax prenanti

2.2 基因引物片段長度驗證

將MyD88和IRF7基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，產(chǎn)物電泳條帶單一明亮，且產(chǎn)物長度與目的片段一致，說明引物設(shè)計合理。

圖1 基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Amplication product of RT-PCR for MyD88 and IRF7 gene

2.3 基因部分序列克隆及序列相似度分析

如圖2，3所示，克隆得到的齊口裂腹魚MyD88基因片段為125 bp，經(jīng)DNAMAN軟件處理可知，所得MyD88 cDNA片段編碼41個氨基酸。齊口裂腹魚IRF7基因片段為142 bp，所得IRF7 cDNA片段編碼47個氨基酸。

從氨基酸序列比對結(jié)果表4，5可以看出，齊口裂腹魚MyD88基因與其他魚類的相似性較高，在81%～97%之間，其中與鯉魚、鯽魚相似性最高，均為97%，其次是赤眼鱒等鯉科魚類，分別為95%、93%和91%，說明MyD88基因與鯉科魚同源性較高。IRF7基因與其他魚類的相似性為69%～87%，鯉魚、鯽魚、草魚分別為91%、87%、87%，其次是斑馬魚，相似性為87%，與墨西哥脂鯉、斑點(diǎn)雀鱔相似性較低分別為76%和69%。說明IRF7基因與鯉科魚同源性較高。

圖2 齊口裂腹魚MyD88基因cDNA片段及推測氨基酸序列Fig.2 Partial nucleotide sequence of MyD88 gene and the deduced amino acids sequence of Schizothorax prenanti

圖3 齊口裂腹魚IRF7基因cDNA片段及推測氨基酸序列Fig.3 Partial nucleotide sequence of IRF7 gene and the deduced amino acids sequence of Schizothorax prenanti

表4 齊口裂腹魚和其他魚類MyD88基因預(yù)測氨基酸的相似度Table 4 Similarity of predicted amino acid sequences of Schizothorax prenanti MyD88 to other fish

表5 齊口裂腹魚和其他魚類IRF7基因預(yù)測氨基酸的相似度Table 5 Similarity of predicted amino acid sequences of Schizothorax prenanti IRF7 to other fish

2.4 分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建及分析

由MyD88基因的分子系統(tǒng)樹圖4可知，鯉魚先與鯽魚聚到一起，然后與齊口裂腹魚聚為一類（Bootstrap value=66），形成一個鯉科魚類小分支；再與團(tuán)頭魴和大菱鲆聚在一起，形成一個鯉科魚類大分支（Bootstrap value=88）；斑點(diǎn)叉尾鮰魚與印度囊鰓鯰聚為一類形成鯰形目小分支 （Bootstrap value=98），最后所有魚類聚為一類，再與恒溫動物牛和綿羊聚到一起。IRF7基因的分子系統(tǒng)樹如圖5所示，齊口裂腹魚與青海湖裸鯉聚到一起，然后與鯉魚聚為一類（Bootstrap value=77），形成一個鯉科魚類小分支；然后與草魚、鯽魚、斑馬魚、墨西哥脂鯉聚為一類形成鯉科魚類大分支 （Bootstrap value=77）；最后與墨西哥脂鯉、歐洲鰻鱺形成魚類大分支。

從電泳、序列克隆測序結(jié)果及序列比對分析結(jié)果可知，本試驗所設(shè)計的MyD88、IRF7基因的引物能有效地擴(kuò)增出對應(yīng)的目的基因片段，且引物特異性良好，可用于后續(xù)試驗。

圖4 齊口裂腹魚MyD88基因分子系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic tree of MyD88 gene of Schizothorax prenanti

圖5 齊口裂腹魚IRF7基因分子系統(tǒng)樹Fig.5 Phylogenetic tree of IRF7 gene of Schizothorax prenanti

2.5 兩種多糖對齊口裂腹魚MyD88、IRF7基因表達(dá)的影響

兩種多糖對齊口裂腹魚不同組織中MyD88基因相對表達(dá)量的影響結(jié)果如圖6-10所示，不同劑量的兩種多糖均能提高腸道MyD88基因相對表達(dá)量，且 OKGMS0.4、OKGM0.8組達(dá)到顯著水平 （P＜0.05）；OKGM1.6能顯著提高頭腎MyD88基因相對表達(dá)量 （P＜0.05）；OKGM0.4能顯著提高中腎 MyD88基因相對表達(dá)量（P＜0.05）；兩種多糖各劑量組對齊口裂腹魚肝臟和脾臟MyD88基因相對表達(dá)量均無顯著影響（P＞0.05）。

圖6 腸道MyD88基因表達(dá)水平圖Fig.6 MyD88 gene expression level in gut

圖7 肝臟MyD88基因表達(dá)水平Fig.7 MyD88 gene expression level in liver

圖8 脾臟MyD88基因表達(dá)水平Fig.8 MyD88 gene expression level in spleen

圖9 頭腎MyD88基因表達(dá)水平Fig.9 MyD88 gene expression level in headkidney

圖10 中腎MyD88基因表達(dá)水平Fig.10 MyD88 gene expression level in mesonephros

兩種多糖對齊口裂腹魚組織IRF7基因相對表達(dá)量的影響結(jié)果如圖11-15所示，OKGMS和OKGM均能提高腸道IRF7基因相對表達(dá)量，OKGM0.4、OKGM1.6組 達(dá) 到 顯 著 水 平 （P＜0.05）；OKGMS0.4、OKGM0.8能顯著提高肝臟IRF7基因相對表達(dá)量 （P＜0.05）；OKGMS1.6和 OKGM0.8顯著上調(diào)脾臟 IRF7 基因相對表達(dá)量 （P＜0.05）；OKGMS1.6與OKGM1.6能提高齊口裂腹魚中腎IRF7基因相對表達(dá)量（P＜0.05）；兩種多糖各劑量組對齊口裂腹魚頭腎IRF7基因相對表達(dá)量均無顯著影響（P＞0.05）。

圖11 腸道IRF7基因表達(dá)水平Fig.11 IRF7 gene expression level in gut

圖12 肝臟IRF7基因表達(dá)水平Fig.12 IRF7 gene expression level in liver

圖13 脾臟IRF7基因表達(dá)水平Fig.13 IRF7 gene expression level in spleen

圖14 頭腎IRF7基因表達(dá)水平Fig.14 IRF7 gene expression level in headkidney

圖15 中腎IRF7基因表達(dá)水平Fig.15 IRF7 gene expression level in mesonephros

3 討論

IgM在魚類血清中的含量高于哺乳動物，是反應(yīng)免疫性能的重要指標(biāo)，在魚類特異性免疫中起著重要作用[12]。多糖具有免疫活性，可通過激活機(jī)體的補(bǔ)體途徑，增強(qiáng)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，進(jìn)而引起血清IgM含量的上升。從兩種多糖對齊口裂腹魚血清免疫指標(biāo)的影響結(jié)果可以看出，OKGMS、OKGM對齊口裂腹魚免疫性能有一定影響，OKGMS1.6能顯著提高齊口裂腹魚血清IgM、ACH50的含量，OKGM組能提高血清中IgM、ACH50的含量但未達(dá)到顯著水平，可能是由于添加劑量較少，未能引起顯著的影響。在其他魚類中也有相似報道。Cerezuela等[13]研究發(fā)現(xiàn)，金頭鯛日糧添加扁藻與三角褐指藻飼喂兩周后，其血清IgM含量顯著提高。Aramli等[14]研究表明，在鱘魚日糧添加β葡聚糖飼喂6周能提高血清ACH50含量，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%劑量組影響顯著。血清MDA的含量可反映出脂質(zhì)的過氧化程度，從而間接地反映出機(jī)體細(xì)胞損害的嚴(yán)重程度。從抗氧化指標(biāo)可以看出，與對照組相比，OKGMS、OKGM能顯著降低血清MDA含量并提高SOD活性。Zheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，齊口裂腹魚日糧添加不同劑量高低相對分子質(zhì)量OKGM均能顯著提高SOD活性，降低血清MDA含量。在其他魚類上也有相似的報道，白東清等[16]研究發(fā)現(xiàn)日糧添加一定劑量黃芪多糖能顯著提高黃顙魚體內(nèi)SOD活性，降低MDA含量。

MyD88作為Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)接分子，是信號傳導(dǎo)的核心環(huán)節(jié)，在魚類免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[17]，在脾臟、腸道、肝臟等組織中均有表達(dá)。IRF7可參與機(jī)體免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)干擾素對外界刺激的反應(yīng)，提高機(jī)體免疫功能[18]。目前，關(guān)于MyD88、IRF7基因的研究多集中在分子特性與克隆及細(xì)菌感染對其在機(jī)體表達(dá)量的影響等方面，而多糖對MyD88、IRF7在組織中表達(dá)量的影響研究較少[19-20]。作者發(fā)現(xiàn)，日糧添加OKGMS及OKGM能上調(diào)齊口裂腹魚組織中MyD88、IRF7基因相對表達(dá)量，但在有些組織影響不顯著，說明這兩種多糖具有提高齊口裂腹魚免疫性能的作用，作用效果與多糖種類、添加劑量及組織差異性相關(guān)。

4 結(jié) 語

OKGMS及OKGM能提高齊口裂腹魚血清免疫指標(biāo)及抗氧化活性，提高組織中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量，可作為一種免疫增強(qiáng)劑添加到飼料中提高機(jī)體免疫性能及抗氧化活性。