和法濤， 劉光鵬， 朱風(fēng)濤，趙 巖， 初 樂，崔春紅

（中華全國供銷總社 濟(jì)南果品研究院，山東 濟(jì)南 250014）

猴頭菇是一種藥食兩用菌，其主要活性物質(zhì)是多糖。研究表明，猴頭菇多糖具有提高免疫力、抗衰老和抗腫瘤等功效[1-5]，在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，猴頭菇多糖的提取方法具有重要意義。

傳統(tǒng)的多糖提取采用熱水提取法，該法耗時(shí)長且效率不高[6-7]。將超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)以及微波的熱效應(yīng)在多糖、黃酮提取中的應(yīng)用已有相關(guān)研究報(bào)道[8]，但有關(guān)微波超聲波組合提取猴頭菇多糖的研究報(bào)道還較少。作者通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化提取工藝，研究了猴頭菇多糖體外抗氧化活性，為猴頭菇多糖生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

猴頭菇：購于金唐食品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子分析天平：德國Sartrius公司產(chǎn)品；萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；微波超聲波組合萃取儀（微波功率：0～1 000 W；超聲波功率：0～1 500 W 連續(xù)可調(diào)（微波頻率：2 450 MHz；超聲波頻率：25 kHz）：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法

1.3.1 多糖檢測 苯酚-硫酸法[9]。

1.3.2 還原糖檢測 菲林試劑法[10]。

1.3.3 羥基自由基清除實(shí)驗(yàn) Fenton模型法[11]。

1.3.4 DPPH自由基清除活性實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.3.5 超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn) 鄰苯三酚自氧化法[13]。

1.4 微波超聲波組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 稱取一定量的猴頭菇粉置于異型三孔燒瓶中，按一定水料比加入蒸餾水，選擇猴頭菇粉碎粒度、提取溫度，水料體積質(zhì)量比、提取時(shí)間、超聲波功率、微波功率為實(shí)驗(yàn)因素，以多糖得率為衡量指標(biāo)，每次改變一個(gè)因素進(jìn)行不同單因素實(shí)驗(yàn)。為響應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖提取工藝提供基礎(chǔ)。

1.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 在單因素條件下初步確定適合猴頭菇多糖微波超聲波組合提取的工藝參數(shù)，再運(yùn)用響應(yīng)面軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，優(yōu)化微波超聲波組合法提取猴頭菇多糖的工藝條件，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)響應(yīng)面優(yōu)化方法的可靠性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用 Microsoft Excel、Design Expert 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和顯著性分析，p<0.05表示具有顯著性差異，p<0.0001表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 猴頭菇粉粒度對(duì)多糖得率的影響 當(dāng)水料體積質(zhì)量比為20 mL/g、提取溫度70℃、提取時(shí)間15 min、微波功率200 W、超聲波功率1 000 W的條件下， 選取過篩孔為 1 980、900、550、380、250、180 μm的猴頭菇粉進(jìn)行提取猴頭菇多糖實(shí)驗(yàn)，考察猴頭菇粉粒度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 猴頭菇粉粒度大小對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of particle size on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

由圖1可知，在其它提取條件一定時(shí)，猴頭菇粉粒度大于550 μm對(duì)多糖得率有較大影響，多糖得率隨著猴頭菇粉過篩篩孔的減小增加較明顯；當(dāng)猴頭菇粉粒度小于550 μm時(shí)，多糖得率增加緩慢。原因可能是微波和超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用，加大了細(xì)胞內(nèi)部有效成分的釋放[14-15]，使得猴頭菇粉碎粒度較小的情況下也能夠得到較高的多糖得率。結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)際生產(chǎn)，選擇猴頭菇粉過篩篩孔的大小為 550 μm。

2.1.2 水料比對(duì)多糖得率的影響 在猴頭菇粉過550 μm篩孔、70℃提取、提取15 min、微波功率200 W、超聲波功率1 000 W的條件下，選取水料體積質(zhì)量比分別為 10、15、20、25、30 mL/g 調(diào)漿，考察水料體積質(zhì)量比對(duì)猴頭菇多糖得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 水料體積質(zhì)量比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effects of the ratio of water to material on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

如圖2所示，在其他條件一定時(shí)，猴頭菇多糖得率隨著水料體積質(zhì)量比的增加先增大后減小，在水料體積質(zhì)量比為20 mL/g時(shí)，猴頭菇多糖的得率取得最大值。這是因?yàn)樵谒象w積質(zhì)量比較小的情況下，較少的溶液使得多糖的浸出率較低；當(dāng)水料比較大時(shí)，較多的溶液就容易造成超聲波的空化效應(yīng)，使其大部分作用在溶劑上而不是作用在物料上進(jìn)而造成多糖得率的降低[16]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，猴頭菇多糖提取的水料體積質(zhì)量比為20 mL/g左右。

2.1.3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 在猴頭菇粉過550 μm篩孔、水料體積質(zhì)量比20 mL/g、提取15 min、微波功率200 W、超聲波功率1 000 W的條件下，設(shè)定提取溫度分別為50～90℃時(shí)，考察提取溫度對(duì)猴頭菇多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

由圖3可得，在其他條件一定時(shí)，提取溫度為50～70℃對(duì)多糖浸出率有較大影響，隨著提取溫度的升高多糖得率明顯增加；當(dāng)提取溫度70℃時(shí)，多糖得率取得實(shí)驗(yàn)最大值；提取溫度70～90℃的多糖得率隨提取時(shí)間增加呈緩慢下降趨勢。分析原因可能是超聲波在較高溫度下對(duì)猴頭菇多糖的結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，從而使得猴頭菇多糖的浸出率隨溫度的升高呈下降趨勢[15]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果，猴頭菇多糖的提取溫度應(yīng)為70℃左右。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 在猴頭菇粉過篩孔大小為550 μm、水料體積質(zhì)量比20 mL/g、提取溫度70℃、微波功率200 W、超聲波功率1 000 W的條件下，設(shè)定提取時(shí)間分別為5～25 min時(shí)，進(jìn)行微波超聲波組合提取猴頭菇多糖實(shí)驗(yàn)，考察提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，所得結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

圖4 可知，在其他條件一定時(shí)，提取5～15 min對(duì)多糖得率影響顯著，隨提取時(shí)間延長，多糖得率增加明顯；提取15 min時(shí)，多糖得率得到實(shí)驗(yàn)最大值；提取15～25 min的多糖得率隨提取時(shí)間增加呈下降趨勢。這是因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、高的加速度、強(qiáng)烈的振動(dòng)等，加速了多糖成分進(jìn)入溶劑，從而利于多糖的浸出，但超聲波作用時(shí)間過長會(huì)使部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而影響了多糖得率。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇猴頭菇多糖的提取時(shí)間為15 min左右。

2.1.5 微波功率對(duì)多糖得率的影響 在猴頭菇粉過550 μm篩孔、水料體積質(zhì)量比20 mL/g、提取溫度70℃、提取15 min、超聲波功率1 000 W的條件下，選取微波功率分別為100～500 W時(shí)，進(jìn)行微波超聲波組合提取猴頭菇多糖實(shí)驗(yàn)，考察微波功率對(duì)多糖得率的影響，所得結(jié)果見圖5。

圖5 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effects of microwave power on the yield ofHericium erinaceus polysaccharides

如圖5所示，在其他條件一定時(shí)，微波功率100～200 W對(duì)多糖得率有較大影響，隨微波功率的增大多糖得率呈增加趨勢；微波功率大于200 W時(shí)，多糖得率緩慢減小。這是因?yàn)槲⒉ㄝ椛淇蓪?dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的水分子吸收微波能形成汽化水，其具有較大的沖擊力，可致使細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁產(chǎn)生微小的空洞和裂紋，促進(jìn)了胞內(nèi)多糖的釋放，從而提高了多糖的浸出率。而微波功率大于200 W條件下，多糖得率稍微下降的原因可能是由于較大的微波功率使提取液溫度較高，多糖的結(jié)構(gòu)被破壞[17]。

2.1.6 超聲波功率對(duì)多糖得率的影響 在猴頭菇粉過550 μm篩孔、水料體積質(zhì)量比20 mL/g、提取溫度70℃、提取15 min、微波功率200 W的條件下，設(shè)定超聲波功率分別為600～1 400 W時(shí)，進(jìn)行微波超聲波組合提取猴頭菇多糖實(shí)驗(yàn)，考察超聲波功率對(duì)多糖得率的影響，所得結(jié)果見圖6。

圖6 超聲波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on the yield ofHericium erinaceus polysaccharides

圖6 可見，在其他條件一定時(shí)，超聲波功率600～1 000 W對(duì)多糖得率影響很大，隨著超聲波功率的增大多糖得率明顯增加；超聲波功率為1 000 W時(shí)，多糖得率為實(shí)驗(yàn)最大值；超聲波功率大于1 000 W的多糖得率隨超聲波功率增加呈緩慢下降趨勢。其原因可能是超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、高的加速度、強(qiáng)烈的振動(dòng)等，加速了多糖成分進(jìn)入溶劑，從而利于多糖的浸出，但超聲波作用功率過大會(huì)破壞部分多糖結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響多糖得率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇猴頭菇多糖的超聲波提取功率為1 000 W左右。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析方案、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析 根據(jù)Design Expert 8.0軟件的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定猴頭菇粉過篩孔大小為550 μm，微波功率200 W，選取對(duì)多糖得率影響顯著的水料體積質(zhì)量比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、超聲波功率（D）為考察因素，用 1、0、-1來表示高、中、低3水平，把多糖得率（Y）作為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平取值見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

利用響應(yīng)面軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合后得到多糖得率對(duì)各因素的回歸方程：0.34B2-0.23C2-0.22D2

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Code and level of variables chosen for the trials

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and responses

由表3得出回歸方程系數(shù)的顯著性，水料體積質(zhì)量比（A）及其二次項(xiàng)A2、提取溫度（B）及其二次項(xiàng)B2、提取時(shí)間（C）及其二次項(xiàng)C2、超聲波功率（D）及其二次項(xiàng)D2、水料體積質(zhì)量比 （A）和提取溫度（B）的交互項(xiàng)AB、水料體積質(zhì)量比（A）和超聲波功率（D）的交互項(xiàng)A D，對(duì)多糖得率具有高度顯著影響；水料體積質(zhì)量比（A）和提取時(shí)間（C）的交互項(xiàng)AC、提取溫度（B）和提取時(shí)間（C）的交互項(xiàng)BC對(duì)多糖得率具有顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面和等高線分析 對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得曲面圖和等高線（圖7～12），圖組能夠直觀地反映對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果及各因素間的交互作用。等高線圓形表示兩因素間交互作用較弱，橢圓形表示較強(qiáng)[18-19]。等高線和響應(yīng)面的最高點(diǎn)能夠得出所選范圍內(nèi)存在極值與否，響應(yīng)面最高點(diǎn)也是等高線最小圓的中心點(diǎn)。

從圖7和圖9的等高線圖可以直觀的看出，在兩個(gè)因素位于中心水平時(shí)，等高線呈橢圓形，說明兩個(gè)圖中的其它兩因素交互作用極顯著；等高線較密集和響應(yīng)曲面的坡度較陡體現(xiàn)出水料比、超聲波功率和提取溫度的變化對(duì)多糖得率變化的影響均較大；由圖7和圖9的三維曲面圖可知，多糖得率均隨著水料比、提取溫度和超聲波功率的增大先快速增大后緩慢減小。從圖8和圖10的等高線圖可以看出，在兩個(gè)因素位于中心水平時(shí)，兩個(gè)圖中的其它兩因素有顯著交互作用；因提取溫度和水料比對(duì)多糖得率響應(yīng)曲面的等高線較密集和坡度較陡，得知兩因素對(duì)多糖得率均有較大影響；從響應(yīng)曲面的等高線較稀疏和坡度較緩，得出提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響相對(duì)較??；圖8和圖10的響應(yīng)面圖表明，多糖得率隨著水料體積質(zhì)量比、提取溫度和提取時(shí)間的增大先快速增大后緩慢減小，但其在增大后減小的幅度大于圖8和圖9三維圖的變化幅度。由圖11和圖12的等高線圖可以直觀的看出，在兩個(gè)因素水平固定的情況下，等高線呈圓形，說明兩個(gè)圖中的其它兩因素交互作用不顯著；由圖11和圖12的三維曲面圖可得，多糖得率隨著超聲波功率、提取溫度和提取時(shí)間的增大先增大后減小，超聲波影響多糖得率的拐點(diǎn)為1 040 W，這可能是因?yàn)檫^大的微波功率導(dǎo)致多糖降解。

2.2.3 最優(yōu)工藝條件預(yù)測、驗(yàn)證及提取方法的比較運(yùn)用響應(yīng)面軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測，得到多糖提取最優(yōu)工藝條件為：水料體積質(zhì)量比20.07 mL/g、提取溫度73.84℃、提取時(shí)間16.23 min、超聲波功率1 052.04 W，在此條件下預(yù)測多糖得率為6.50%。該提取方法與傳統(tǒng)熱水提取法、超聲波提取法和微波提取法進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。微波超聲組合法提取猴頭菇多糖，具有節(jié)省時(shí)間，高多糖浸出率的優(yōu)點(diǎn)。

圖8 水料體積質(zhì)量比與提取時(shí)間交互作用影響多糖得率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.8 Response surface plot and its contour plot showing the effects of the ratio of water to material and extraction time and their mutual interactions on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

圖9 水料體積質(zhì)量比與超聲波功率交互作用影響多糖得率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.9 Response surface plot and its contour plot showing the effects of the ratio of water to material and ultrasonic Power and their mutual interactions on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

圖10 提取溫度與提取時(shí)間交互作用影響多糖得率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.10 Response surface plot and its contour plot showing the effects of extraction temperature and extraction time and their mutual interactions on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

圖11 提取溫度與超聲波功率交互作用影響多糖得率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.11 Response surface plot and its contour plot showing the effects of extraction temperature and ultrasonic Power and their mutual interactions on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

圖12 提取時(shí)間與超聲波功率交互作用影響多糖得率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.12 Response surface plot and its contour plot showing the effects of extraction time and ultrasonic Power and their mutual interactions on the yield of Hericium erinaceus polysaccharides

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Verified results of the model equation

2.3 猴頭菇多糖體外抗氧化活性測定

2.3.1 羥基自由基清除活性 猴頭菇多糖清除羥基自由基的能力較強(qiáng)，對(duì)羥基自由基的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，但VC對(duì)羥基自由基的清除率均高于同質(zhì)量濃度下猴頭菇多糖對(duì)羥基自由基的清除率。

2.3.2 DPPH自由基清除活性 從圖14可知，猴頭菇多糖的質(zhì)量濃度與對(duì)DPPH自由基的清除率呈正相關(guān)，樣品的質(zhì)量濃度越高，DPPH自由基的清除率越大。與同質(zhì)量濃度的VC相比，猴頭菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除率明顯較強(qiáng)。

2.3.3 超氧陰離子自由基清除活性 VC和猴頭菇多糖對(duì)超氧陰離子均具有一定的清除作用，對(duì)超氧陰離子的清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，但猴頭菇多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力明顯低于VC的清除能力。

3 結(jié) 語

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，微波超聲波組合法提取猴頭菇多糖工藝使用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，建立以多糖得率為目標(biāo)值，以水料體積質(zhì)量比、提取溫度、提取時(shí)間和超聲波功率為因子的回歸方程模型。驗(yàn)證證實(shí)，模型能夠用于猴頭菇多糖提取得率的預(yù)測。最終確定微波超聲波組合法提取猴頭菇多糖提取工藝參數(shù)為：猴頭菇粉過篩孔大小為550 μm、水料體積質(zhì)量比20 mL/g、提取溫度74℃、提取時(shí)間16 min、微波功率200 W、超聲波功率1 052 W，在此最優(yōu)條件下，多糖得率6.44%，與預(yù)測值非常接近。微波超聲波提取是利用微波的熱效應(yīng)和對(duì)猴頭菇細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的破壞力以及超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，增加猴頭菇細(xì)胞內(nèi)多糖物質(zhì)的溶出率和增大介質(zhì)的穿透力及分子的運(yùn)動(dòng)速度，來提取猴頭菇多糖的方法。該方法與傳統(tǒng)熱水提取法、超聲波提取法和微波提取法相比，具有節(jié)省時(shí)間，高多糖浸出率的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于工廠的實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。另外，通過對(duì)猴頭菇多糖的體外抗氧化研究，得出猴頭菇多糖抗氧化活性較好，表現(xiàn)為對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除作用。猴頭菇多糖的體內(nèi)生物功效有待于進(jìn)一步深入研究。