呂紅君，溫桃群，羅 杰，劉小波，楊 菊，曾 南

(1. 成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；2. 四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610064)

荊芥為唇形科一年生草本植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥地上部分，是臨床常用解表藥，其味辛性平而偏寒，具有良好的祛風解表功效，臨床上常用于治療與風邪有關的表證及皮膚、頭目疾患，而這些疾病都與炎癥的病理過程相關。荊芥揮發(fā)油(essential oils ofSchizonepetatenuifoliaBriq., EOST)含量豐富，是其辛味藥性的物質(zhì)基礎之一[1]。實驗室前期研究表明，EOST預防給藥能通過下調(diào)促炎因子的釋放，減輕炎性細胞浸潤等，抑制炎癥反應，從而發(fā)揮對內(nèi)毒素中毒模型小鼠的保護作用，但其抗炎效應的分子機制有待進一步研究[2]。本研究基于前期藥效研究基礎，從NLRP3炎癥小體激活角度，探討EOST對內(nèi)毒素中毒模型小鼠保護作用的抗炎效應機制，以期進一步揭示其抗炎作用機制，為EOST治療“表證”的臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物♂C57BL/6J小鼠(動物合格證號11400700130007)，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2藥物與試劑荊芥，購自成都新荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室嚴鑄云教授鑒定，為唇形科一年生草本植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的地上部分。EOST的制備同文獻[2]，實驗時用0.35%吐溫-80(Tween-80)配制藥物，給藥劑量分別為其半數(shù)致死量(LD50)的1/10和1/5，即0.226、0.452 g·kg-1。地塞米松、脂多糖(lipopolysaccharides from Escherichia coil 055:B5, LPS)，均購自美國Sigma公司; NO試劑盒，購自碧云天生物技術研究所;FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)，均購自天根生化科技(北京)有限公司；AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit, 購自Axygen公司；抗組織蛋白酶(Cathepsin)B、嘌呤受體 P2X7(purinergic 2X7 receptor, P2X7R)、GADPH、COP1抗體，均購自美國Abcam公司；抗NLRP3、pro-IL-1β抗體，均購自美國Cell Signaling公司；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素(HRP/A-V)、濃縮型DAB試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；凋亡相關的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC) 抗體，購自Abbexa; caspase-1(p20)抗體，購自Santa Cruz公司；引物均由Invitrogen公司設計。

1.3儀器酶標儀、NanoDrop 2000(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；2015型輪轉(zhuǎn)式切片機(德國徠卡公司)；TSJ-Ⅱ型組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)；BA200Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)。

2 方法

2.1實驗分組、給藥與造模取健康C57BL/6J♂小鼠，按體質(zhì)量分層，隨機分為空白組、模型組、地塞米松(0.005 g·kg-1)組、EOST(0.226、0.452 g·kg-1)組。除地塞米松組在d 4、5腹腔注射給藥2次外，其余給藥組小鼠按20 mL·kg-1體積灌胃給藥，空白組與模型組給予等體積0.35%吐溫-80溶液，連續(xù)給藥5 d。末次給藥后30 min，小鼠腹腔注射LPS (0.015 g·kg-1，10 mL·kg-1) 造模，造模后12 h剖取小鼠肺組織，將右肺置于-80℃保存，左肺置于體積分數(shù)為10%的中性福爾馬林溶液中，用于免疫組化實驗。

2.2小鼠肺組織中NO含量的檢測按試劑盒說明書制備肺組織勻漿，采用Griess法進行NO含量測定。

2.3小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65mRNA的檢測取 “2.1”項下所得右肺組織于冰上解凍后，按照Axygen總RNA小量制備試劑盒步驟提取總RNA，測定總RNA純度和濃度，并檢測所得總RNA樣本的完整性(瓊脂糖凝膠)。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qPCR分析NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65 mRNA的表達。采用相對定量法，以GADPH基因為內(nèi)參基因，以樣本的平均Ct值作為校正值，通過差異值反映EOST對模型小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65 mRNA表達的影響。引物序列見Tab 1。

2.4免疫組化檢測小鼠肺組織CathepsinB、P2X7R的表達將 “2.1”項下所得左肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，熱抗原修復和山羊血清封閉后，用一抗、二抗孵化，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片。采集圖像，細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺黃色或棕色的顆粒物質(zhì)為陽性表達。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測定所采集全部圖像的平均光密度(平均光密度=黃色或棕色部分的累積光密度值/照片面積)。

2.5Westernblot檢測小鼠肺組織NLRP3、caspase-1(p20)、pro-IL-1β、COP1蛋白表達取各組小鼠右肺組織40 mg，加入液氮制成粉末狀，再加入400 μL RIPA裂解液制備勻漿，4℃、10000 r·min-1離心5 min，取上清，釆用BCA法測定蛋白含量，將所有蛋白樣本調(diào)至等濃度。取低溫保存的蛋白樣品，95 ℃水浴加熱5 min后，上樣電泳。采用濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用封閉液(5%脫脂牛奶)封閉2 h，加入一抗孵育過夜，漂洗后，加入二抗孵育1.5 h。顯色液顯色后測定灰度值，運用 Image lab圖像分析系統(tǒng)測定光密度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值即為蛋白相對含量，進行統(tǒng)計分析。

Tab 1 Gene primer sequences

3 結(jié)果

3.1EOST對LPS中毒模型小鼠肺組織NO含量的影響如Tab 2所示，模型組小鼠NO含量較空白對照組明顯升高(P<0.05)；EOST 0.452 g·kg-1劑量組小鼠肺組織NO含量較模型組明顯降低(P<0.05)。

Tab 2 Effect of EOST on level of NO in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin n=7～8)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel

3.2EOST對模型小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65mRNA表達的影響Tab 3所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、iNOS、p65、IL-1β mRNA表達水平明顯升高(P<0.01，P<0.05)，提示NLRP3炎癥小體被激活。與模型組比較，EOST 0.452 g·kg-1明顯降低小鼠肺組織中NLRP3、iNOS、p65、IL-1β mRNA的表達(P<0.01，P<0.05)。

3.3EOST對內(nèi)毒素中毒模型小鼠肺組織CathepsinB、P2X7R表達的影響由Fig 1可知，與空白組相比，模型組小鼠肺組織Cathepsin B、P2X7R蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，EOST 0.226 g·kg-1明顯降低模型小鼠肺組織Cathepsin B蛋白含量(P<0.01)，EOST 0.452 g·kg-1明顯降低小鼠肺組織中P2X7R蛋白含量(P<0.05)。

3.4EOST對中毒模型小鼠肺組織NLRP3、caspase-1(p20)、pro-IL-1β、COP1蛋白表達的影響如Fig 2所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中NLRP3、p20、pro-IL-1β蛋白表達量明顯上升(P<0.01，P<0.05)，COP1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，EOST(0.226、0.452 g·kg-1)能明顯下調(diào)p20蛋白水平(P<0.01，P<0.05)，二者亦能明顯升高COP1蛋白水平(P<0.01，P<0.05)；EOST 0.226 g·kg-1明顯下調(diào)NLRP3蛋白表達水平(P<0.05)。

4 討論

病原微生物的感染是“表證”的一個主要病因，炎癥反應是“表證”的一個主要病理環(huán)節(jié)，解表藥的解表功效與其抗炎作用密切相關。由于肺為“嬌臟”，易受外邪入侵，且“肺主皮毛”，然“皮毛”為一身之表，有抵御外邪之功能，是人體抵抗外邪的屏障。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的重要成分，作為細菌分泌的內(nèi)毒素，是導致炎癥反應發(fā)生的重要原因。本研究選擇LPS腹腔注射誘導的內(nèi)毒素中毒模型小鼠，基于前期藥效學的研究基礎[2]，以NLRP3炎癥小體通路為切入點，探討EOST對內(nèi)毒素中毒模型小鼠保護作用的抗炎效應分子機制，為荊芥“解表祛邪”功效的科學內(nèi)涵闡釋提供更為豐富的科學依據(jù)。

Tab 3 Effect of EOST on expressions of NLRP3, ASC, caspase-1, IL-1β, iNOS, p65 mRNA in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin n=4～5)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig1EffectofEOSTonproteinexpressionsofCathepsinBandP2X7Rinlungtissuesofinflammatorymiceinducedbyendotoxin

Fig 2 Effect of EOST on expressions of NLRP3, caspase-1(p20), pro-IL-1β, COP1 protein in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin n=4)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

機體在受到革蘭陰性細菌感染時，LPS作用于細胞膜受體，可導致大量炎性細胞因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。NO是內(nèi)毒素中毒機體產(chǎn)生的一種重要活性物質(zhì)，其參與炎癥反應，作用復雜，在不同類型的炎癥反應和炎癥階段發(fā)揮著抗炎或者促炎的作用。體內(nèi)NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生，NOS包括結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(constitutive NOS, cNOS)和誘導型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS)，cNOS 可源源不斷地產(chǎn)生，而iNOS只有在受到感染或其他刺激時才產(chǎn)生[3]。炎癥反應中，經(jīng)LPS和細胞因子刺激后，會生成iNOS，從而合成大量NO[4]。在高濃度條件下，NO激活NF-κB，誘導促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β等的產(chǎn)生，TNF-α的產(chǎn)生又可激活iNOS，促進機體產(chǎn)生更多的NO，從而形成正反饋循環(huán)，使炎癥細胞因子的分泌及NO自身的表達得以持續(xù)，致使炎癥反應更持久、劇烈[5]。文獻表明，薄荷酮抗炎作用的發(fā)揮可能通過影響 NO 的釋放，來干擾NLRP3炎癥小體的激活[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，由LPS引起的中毒模型小鼠肺組織中NO的水平和 iNOS基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高，表明小鼠處于炎癥病理狀態(tài)。EOST能減少模型小鼠肺組織中NO水平，下調(diào) iNOS mRNA表達水平，進一步驗證表明該揮發(fā)油對內(nèi)毒素中毒模型小鼠有抗炎保護作用。

NLRP3炎癥小體由核心蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC和效應蛋白caspase-1組成，能被一些內(nèi)源性危險信號和外源性因素所激活，包括活性氧(reactive oxygen species, ROS)、LPS等[7-8]。NLRP3炎癥小體受到這些激活劑刺激后，效應蛋白caspase-1會負責將無活性的前炎癥因子Pro-IL-18和Pro-IL-1β剪切為成熟的IL-18和IL-1β，從而激活下游相關信號通路，生成大量的炎癥介質(zhì)，誘導機體發(fā)生嚴重的炎癥反應。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)內(nèi)毒素攻擊后，其肺組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β mRNA表達明顯升高，肺組織NLRP3、caspase-1(p20)和 Pro-IL-1β 蛋白表達亦明顯增加，表明該模型小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體信號通路被激活，而EOST預防性給藥，可明顯下調(diào)模型小鼠肺組織中NLRP3、IL-1β mRNA和NLRP3、caspase-1(p20)蛋白表達水平，提示EOST對NLRP3炎癥小體信號通路的激活具有抑制作用。

NLRP3炎癥小體上游通路較為復雜，其激活的機制也不盡相同。其中， P2X7R是ATP門控離子通道，參與了機體免疫反應。K+外流是NLRP3炎癥小體活化的關鍵環(huán)節(jié)，細胞內(nèi)的K+可通過P2X7R外流，進而激活NLRP3炎癥小體信號通路[9]。受到ATP刺激后，溶酶體被破壞，釋放的Cathepsin B等多種溶酶體水解酶可介導NLRP3炎癥小體的激活[10]。p65作為NF-κB信號通路激活的標志性蛋白，p65 mRNA的表達增加則表明NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)，調(diào)控NF-κB的活性能間接影響NLRP3炎癥小體的激活[11]。只含CARD結(jié)構(gòu)域蛋白COP1在炎癥小體調(diào)控中發(fā)揮重要作用，COP1含有1個與caspase-1相似的CARD結(jié)構(gòu)域，所以COP1可以通過競爭caspase-1，干擾炎癥小體的組裝，從而負向調(diào)控NLRP3炎癥小體活化[12]。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織 P2X7R、Cathepsin B蛋白表達明顯升高，p65、caspase-1 mRNA表達明顯增高，COP1蛋白表達明顯降低，表明該模型小鼠肺組織NLRP3炎癥小體激活，其激活機制涉及多條上游信號通路。EOST預防性給藥，能明顯下調(diào)模型小鼠肺組織中P2X7、Cathepsin B蛋白，以及p65、caspase-1 mRNA的表達，明顯上調(diào)COP-1蛋白表達，提示EOST抑制NLRP3炎癥小體的激活是其抗炎作用機制之一，可能通過影響K+/P2X7R、溶酶體/Cathepsin B、NF-κB、COP-1/caspase-1等多種途徑，發(fā)揮抑制效應。

綜上，LPS所誘導的中毒模型小鼠體內(nèi)NLRP3炎癥小體信號通路呈現(xiàn)激活狀態(tài)，EOST對內(nèi)毒素中毒模型小鼠有抗炎保護效應，且EOST抑制NLRP3炎癥小體的激活是通過干擾K+/P2X7R、溶酶體/Cathepsin B、NF-κB、COP-1/caspase-1等多途徑發(fā)揮作用的，但對于炎癥小體激活后其聚合體之間關系的變化尚不明晰，有待進一步深入。