王秀男，陶慧娟，陳榮芳，班建東，農(nóng) 君，廖 明，張學(xué)榮

(廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021)

肝纖維化是肝硬化、肝癌和肝功能衰竭的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段，特征是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是合成ECM的關(guān)鍵細(xì)胞，因此抑制其增殖并誘導(dǎo)其凋亡是抗肝纖維化的關(guān)鍵[1]。細(xì)胞毒素(cytotoxin，CTX)是眼鏡蛇毒的主要活性成分，生物活性多樣，對(duì)多種細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性[2]，在抗腫瘤研究中具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。本研究以HL7702細(xì)胞為對(duì)照，探索CTX-1對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX2的選擇性抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人肝星狀細(xì)胞株LX2，由廣西醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室饋贈(zèng)；人正常肝細(xì)胞株HL7702，由廣西醫(yī)科大學(xué)生化教研室饋贈(zèng)。

1.1.2主要試劑與儀器 廣西眼鏡蛇毒凍干粉，由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供；DEAE-Sepharose CL-6B填料(美國(guó)Pharmacia Biotech公司)；Spehadex G-50填料(GE公司)；Macro-prep High S 預(yù)裝柱(Bio-Rad公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒(聯(lián)科生物公司)。KTATMstart層析系統(tǒng)(GE公司)；酶標(biāo)儀( Biotek公司)；流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2方法

1.2.1眼鏡蛇毒CTX-1的分離純化 稱取1 g廣西眼鏡蛇毒粗毒凍干粉，溶解，離心，過(guò)濾上清后，經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B陰離子交換柱、Spehadex G-50凝膠柱、Macro-prep High S陽(yáng)離子交換柱分離純化。取活性峰凍干粉，采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度鑒定,NanoLC-ES-I-MS/MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將LX2、HL7702細(xì)胞都分為空白組和實(shí)驗(yàn)組(CTX-1濃度分別為0.5、1、2 、4、8、16 mg·L-1)，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖抑制率。抑制率=[(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(空白組OD值-培養(yǎng)基組OD值)]×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將LX2、HL7702細(xì)胞都分為空白組和實(shí)驗(yàn)組(CTX-1濃度分別為1、2 、4 mg·L-1)，采用Annexin V-APC/7-AAD雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1CTX-1的分離純化廣西眼鏡蛇毒粗毒凍干粉經(jīng)三步層析，分離所得活性峰經(jīng)鑒定確定為電泳純的CTX-1，分子量為9.498 ku。

Tab 1 Effect of CTX-1 on proliferation of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2CTX-1選擇性抑制LX2細(xì)胞增殖CCK-8結(jié)果顯示(Tab 1)，CTX-1對(duì)兩種細(xì)胞的增殖有抑制作用，呈劑量依賴性。CTX-1抑制LX2細(xì)胞增殖的最低有效濃度為0.5 mg·L-1(P﹤0.05)；抑制HL7702細(xì)胞增殖的最低有效濃度為8 mg·L-1(P<0.05)。CTX-1對(duì)LX2細(xì)胞有明顯的抑制作用，其IC50為2.50 mg·L-1，而CTX-1對(duì)HL7702抑制作用較弱，IC50達(dá)到18.97 mg·L-1，說(shuō)明CTX-1在抑制細(xì)胞增殖方面具有選擇性。

2.3CTX-1選擇性誘導(dǎo)LX2細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(Tab 2)，CTX-1誘導(dǎo)LX2細(xì)胞凋亡的最小濃度為2 mg·L-1(P<0.05)；誘導(dǎo)HL7702細(xì)胞凋亡的最小濃度為4 mg·L-1(P<0.05)，說(shuō)明CTX-1誘導(dǎo)LX2細(xì)胞凋亡的作用更強(qiáng)。

Tab 2 Effect of CTX-1 on apoptosis of

*P<0.05vscontrol

3 討論

本研究利用層析法從廣西眼鏡蛇毒分離純化得到電泳純的CTX-1，證實(shí)CTX-1對(duì)LX2細(xì)胞增殖抑制能力強(qiáng)于HL7702，誘導(dǎo)LX2細(xì)胞凋亡的作用也更強(qiáng)，而對(duì)HL7702影響較小。以上結(jié)果說(shuō)明，CTX-1具有選擇性殺傷LX2細(xì)胞的特性。本研究首次探討CTX-1對(duì)LX2細(xì)胞的抑制作用，為肝纖維化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。