王 超，劉 玉，安 然，趙京山，孫佳歡，李愛英

(1. 河北省人民醫(yī)院代謝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2. 河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與生物學(xué)教研室，河北省心腦血管中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200)

隨著社會的老齡化，動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病率逐年升高。目前，臨床上常用血管旁路移植、動脈球囊擴(kuò)張術(shù)、支架置入術(shù)等血管重建術(shù)作為此類疾病治療方法，但術(shù)后的再狹窄大大降低了其治療效果，尋找一種安全有效、用藥簡便的藥物一直是血管再狹窄研究的熱點(diǎn)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是構(gòu)成血管壁結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞成分，同時(shí)還具有維持血管張力的作用，VSMC異常增生是動脈粥樣硬化、血管重建術(shù)后再狹窄、高血壓等心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1-2]。在一些因素的刺激下，VSMC能夠表現(xiàn)出與腫瘤細(xì)胞類似的生物學(xué)行為[3]，因此，應(yīng)用抗腫瘤藥物防治血管再狹窄作為一種新的治療策略正在被大量研究。

Roscovitine是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有低毒、高效的特點(diǎn)，目前處于非小細(xì)胞肺癌、血液病等癌癥的Ⅱ期臨床研究。越來越多的研究表明，Roscovitine具有抗炎、抗增殖、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理功能，預(yù)示了Roscovitine可作為防治血管再狹窄的潛在藥物[4-5]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)誘導(dǎo)體外VSMC增殖，觀察Roscovitine對VSMC增殖及細(xì)胞周期的影響，為臨床上血管再狹窄防治提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康SD♂大鼠，體質(zhì)量80～100 g，SPF級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，光照12 h·d-1，溫度(20～26) ℃，相對濕度40%～70%，自由攝食和飲水。

1.2試劑CDK抑制劑Roscovitine購自Gibco公司；TNF-α購自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自上海博谷生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自大連寶生物有限公司；蛋白定量分析試劑盒購自美國Pierce公司；引物購自上海生工生物技術(shù)公司；兔抗Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E多克隆抗體，兔抗CDK4、CDK5多克隆抗體，兔抗p53蛋白、p21蛋白、p27蛋白多克隆抗體，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體，均購自美國Abcam公司。

1.3儀器SpectraMax M2酶標(biāo)分析儀(美國分子儀器公司)；Epics XL流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)；7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Gel Doc XR+凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)；DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀、DYY-Ⅲ40B型轉(zhuǎn)膜槽(北京六一儀器廠)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組健康SD大鼠，戊巴比妥鈉45 mg·kg-1注射麻醉，取大鼠的胸腹主動脈血管，采用貼塊法培養(yǎng)VSMC。具體培養(yǎng)過程：VSMC培養(yǎng)于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，常規(guī)胰蛋白酶消化，顯微鏡下細(xì)胞呈典型的"峰谷"樣生長，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將同步于靜止期的VSMC分為正常對照組、TNF-α組(100 μg·L-1TNF-α)、Roscovitine組(加入5、10、15、30 μmol·L-1Roscovitine預(yù)處理15 h的VSMC，后加入終濃度為100 μg·L-1TNF-α)，不同處理組作用24 h后，收集細(xì)胞。

1.5MTT法檢測細(xì)胞增殖收集細(xì)胞前4 h，96孔板各孔加入10 μL MTT，于37 ℃孵育4 h，棄去孔中上清液，加入100 μL DMSO至充分溶解為藍(lán)紫色溶液，采用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞各孔的吸光度(absorbance，A)值，測定波長為570 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，A值的大小可反映VSMC增殖程度。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期處理后的細(xì)胞，PBS洗滌后離心，制備單細(xì)胞懸液，采用Annexin V-FITC/PI雙染法上機(jī)檢測，用自帶軟件分析10 000個細(xì)胞周期時(shí)相。

1.7Real-timeRT-PCR測定目的基因mRNA的表達(dá)收集細(xì)胞，加入TRIzol試劑，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后按試劑盒說明順序加樣進(jìn)行體系反應(yīng)，將β-actin設(shè)為內(nèi)參上機(jī)檢測，擴(kuò)增結(jié)束，PCR儀分析軟件進(jìn)行分析，以相對表達(dá)量(relative quantity，RQ)值反映目的基因mRNA相對表達(dá)水平。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence

1.8Westernblot法檢測目的蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，電泳，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入稀釋濃度的PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E、CDK4、CDK5、p53、p21、p27一抗孵育，后加入對應(yīng)反應(yīng)的二抗，化學(xué)發(fā)光法顯影。測定條帶的光密度值，β-actin做為內(nèi)參，以目的條帶光密度值和β-actin光密度值的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1Roscovitine對大鼠VSMC增殖的影響如Fig 1所示，與正常對照組比較，TNF-α組細(xì)胞A值明顯升高(P<0.05)，Roscovitine (5、10、15、30 μmol·L-1)組比TNF-α組A值明顯降低(P<0.05)。Fig 2結(jié)果顯示，與正常對照組比較，TNF-α組PCNA蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Roscovitine (5、10、15、30 μmol·L-1)組比TNF-α組PCNA蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。表明Roscovitine能抑制VSMC增殖。

2.2Roscovitine對大鼠VSMC細(xì)胞周期的影響如Fig 3所示，TNF-α組G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常對照組，S期細(xì)胞數(shù)量高于對照組(P<0.05)，Roscovitine (5、10、15、30 μmol·L-1)組比TNF-α組G0/G1期細(xì)胞數(shù)量升高，S期細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05)。表明Roscovitine抑制細(xì)胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化。

Fig 1 Effect of roscovitine on cell proliferation induced by

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsTNF-α group

Fig 2 Effect of roscovitine on

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsTNF-α group

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsTNF-α group

2.3Roscovitine對大鼠VSMC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響如Fig 4所示，與正常對照組比較，TNF-α組Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；Roscovitine處理后，能明顯降低TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白表達(dá)(P<0.05)。

Fig 4 Effect of roscovitine on protein(A) and mRNA(B)expression of cell cycle

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsTNF-α group

2.4Roscovitine對大鼠VSMC中CDK4、CDK5表達(dá)的影響如Fig 5所示，TNF-α組比正常對照組CDK4、CDK5表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Roscovitine (5、10、15、30 μmol·L-1)組比TNF-α組CDK4、CDK5表達(dá)下降(P<0.05)。

Fig 5 Effect of roscovitine on protein(A) and mRNA(B) expression of cyclin-dependent

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsTNF-α group

2.5Roscovitine對大鼠VSMC細(xì)胞周期抑制蛋白p53、p21、p27表達(dá)的影響如Fig 6所示，Roscovitine 5、10、15、30 μmol·L-1組比TNF-α組p53、p21、p27 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)。

3 討論

Roscovitine是嘌呤類似物，具有毒性低、活性高的特點(diǎn)，作為一種新型的抗腫瘤藥物被大量研究。Roscovitine能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，而對正常細(xì)胞幾乎無影響，例如，有研究報(bào)道Roscovitine能夠抑制乳腺癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞等增殖[6-7]。研究表明，刺激能夠使VSMC增殖，呈現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞相似的生物學(xué)行為，且二者許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一致[3]，將抗腫瘤藥物用于治療血管增生性疾病可能是一種新的治療策略。Roscovitine與其衍生物能明顯抑制血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的VSMC增殖[8]。我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，Roscovitine能明顯抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的大鼠VSMC增殖[9]。本研究中，我們采用TNF-α誘導(dǎo)體外VSMC增殖，結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)的VSMC增殖活力明顯增加，同時(shí)還觀察到PCNA表達(dá)異常升高，給予Roscovitine干預(yù)后，能使VSMC增殖及PCNA表達(dá)降低，表明Roscovitine能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的大鼠VSMC增殖。

Fig 6 Effect of roscovitine on protein(A) and mRNA(B)expression of cell cycle inhibitory

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsTNF-α group

大量研究表明，VSMC增生與多種調(diào)節(jié)基因相關(guān)，但細(xì)胞周期調(diào)控是增生的最終共同途徑[10]，細(xì)胞周期抑制劑應(yīng)用于臨床也已成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)[11-12]。我們觀察到Roscovitine能夠抑制VSMC細(xì)胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，表明Roscovitine能夠使VSMC細(xì)胞周期阻滯在S期，調(diào)控VSMC細(xì)胞周期。

Cyclins-CDKs-細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinase inhibitor,CDKI)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)在細(xì)胞生長和分化中備受關(guān)注，不同類型Cyclins在細(xì)胞細(xì)胞周期內(nèi)有不同的作用，其水平也會發(fā)生變化。Cyclin A和B參與細(xì)胞周期中的S或M期，與DNA復(fù)制密切有關(guān)，而Cyclin D和E類型屬細(xì)胞中的G1期，參與G1/S周期轉(zhuǎn)換[13]。Cyclins和CDKs結(jié)合，不同的Cyclin/CDK復(fù)合物在細(xì)胞周期的特異位點(diǎn)組裝，發(fā)揮相應(yīng)的作用。同時(shí)，CDK活性還要受CDKIs抑制，CDKI可以與Cyclin/CDK復(fù)合物結(jié)合，也可以通過與CDK單體結(jié)合，阻斷復(fù)合物的生成。我們觀察到TNF-α誘導(dǎo)VSMC后，Cyclins-CDKs-CDKIs系統(tǒng)平衡被打破，Roscovitine能降低細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4、CDK5蛋白表達(dá)，升高細(xì)胞周期抑制蛋白p53、p21、p27蛋白表達(dá)，表明Roscovitine能調(diào)控大鼠VSMC的增殖，調(diào)節(jié)Cyclins-CDKs-CDKIs系統(tǒng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Roscovitine可與ATP競爭結(jié)合CDK的活性位點(diǎn)，調(diào)控VSMC細(xì)胞周期。