薛丕良，李鳳金，白茹，劉欣欣，袁茵，肖洪彬，牛雯穎*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病是血清特異性抗體與足細(xì)胞表達(dá)的自身抗原結(jié)合引發(fā)的自身免疫性疾病，上皮下出現(xiàn)免疫復(fù)合物沉積和補(bǔ)體激活導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障功能障礙和蛋白尿形成。胸腺和脾臟是人體重要的免疫器官，白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是胸腺基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過與胸腺細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞的發(fā)育，促進(jìn)T細(xì)胞的分化成熟。本實(shí)驗(yàn)主要觀察大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平以及胸腺和脾臟指數(shù)。探討參芪蛭龍湯的作用機(jī)制及IL-2、IL-6和TNF-α與膜性腎病發(fā)病的關(guān)系。

1 材料

1.1 主要儀器

全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：iMarkTM)；日立透射電子顯微鏡(上海鑄金分析儀器有限公司，型號(hào)：H-7650)。

1.2 藥物及試劑

參芪蛭龍湯(組方:黨參、黃芪、當(dāng)歸、川芎、水蛭、地龍、僵蠶、虎杖、淫羊藿和鳳尾草，中藥飲片購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)；大鼠白介素(IL-2)檢測(cè)試劑盒、白介素(IL-6)檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批號(hào)：20180702)。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(228±19)g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(黑)2008-004。

2 方法

2.1 藥物制備

參芪蛭龍湯由黨參20 g，黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g,水蛭5 g(研末沖服),地龍20 g，僵蠶15 g，虎杖15 g，淫羊藿30 g和鳳尾草15 g組成。以上10味，加12倍量水浸泡1 h，煎煮1 h后，濾過。藥渣再加10倍量水煎煮1 h，濾過。合并2次濾液，60℃濃縮成1∶1的藥液，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)制備

參照Border法[1]，取67 mL無水乙二胺(EDA)液，加入500 mL雙蒸水，再加入6 mol/L鹽酸350 mL，調(diào)整pH值到4.75，冷卻至25℃，進(jìn)行攪絆，再加入天然牛血清白蛋白(N-BSA)5 g溶于25 mL重蒸餾水的溶液，攪拌完全后再加1.8 g炭化二亞胺鹽酸鹽(EDCHCL)維持25℃，持續(xù)攪拌2 h，保持pH值4.75，最后加入4 mol/L(pH值4.75)的醋酸緩沖液30 mL，終止反應(yīng)，即得到等電點(diǎn)提高的C-BSA溶液。將C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的雙蒸水透析72 h(3～5 h換水1次)，冷凍干燥后，即得BSA干粉。用聚丙烯酰胺等測(cè)定其等電點(diǎn)(PI)，PI>8.5即可。C-BSA保存于-40℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 膜性腎病大鼠模型復(fù)制

取Wistar大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠置于代謝籠中，接24 h尿液，測(cè)尿蛋白含量。

預(yù)免疫：對(duì)尿蛋白陰性的大鼠，留出10只作空白對(duì)照，對(duì)其余大鼠進(jìn)行預(yù)免疫。將80 mg C-BSA溶于15 mL PBS中，與等量弗氏不完全佐劑混合，超聲乳化完全后進(jìn)行預(yù)免疫。除空白對(duì)照組外，于每只大鼠腹股溝、腋窩等處進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，每只0.3 mL 的乳化物，每點(diǎn)注射不超過0.05 mL。正常對(duì)照組則以PBS與弗氏不完全佐劑按上述比例乳化后進(jìn)行皮下注射。1周后，進(jìn)行正式免疫(制作模型)：每次將C-BSA溶于1 mL PBS中進(jìn)行尾靜脈注射，首次C-BSA尾靜脈注射量為3.5 mg/只，隔日1次，每周3次，6周內(nèi)緩慢將注射量遞增至5 mg/只，正常對(duì)照組注射同體積的PBS。6周后留取動(dòng)物24 h尿液，測(cè)尿蛋白含量。

2.4 分組給藥

將造模成功的30只大鼠按照尿蛋白數(shù)值隨機(jī)分為參芪蛭龍湯低劑量組、高劑量組和模型組，每組10只。參芪蛭龍湯組灌胃給藥劑量為4 g生藥/kg和8 g生藥/kg?？瞻捉M和模型組大鼠灌胃給予等體積的蒸餾水。在造模2周后開始給予中藥湯劑早晚各1次，連續(xù)給藥4周。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

2.5.1 血清中IL-2、IL-6、TNF-α的水平

采用IL-2、IL-6、TNF-α測(cè)試盒，用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測(cè)大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α的水平。

2.5.2 胸腺和脾臟指數(shù)

稱大鼠體質(zhì)量后，采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠胸腺和脾臟，稱內(nèi)臟重量；計(jì)算出臟器指數(shù)(內(nèi)臟)。

臟器指數(shù)(%)= 脾臟或胸腺質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%

2.5.3 電鏡觀察大鼠腎組織病理形態(tài)

電鏡標(biāo)本(取1 mm×1 mm×1 mm大小腎皮質(zhì))采用2.5%戊二醛固定液固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 對(duì)膜性腎病大鼠體質(zhì)量的影響

由表1可見，造模前，各組大鼠間體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠給藥后體質(zhì)量顯著降低(P<0.01),而參芪蛭龍湯組大鼠體質(zhì)量有升高趨勢(shì)，但與模型組比較，無顯著差異性(P>0.05)。

表1 參芪蛭龍湯對(duì)膜性腎病大鼠體質(zhì)量的影響比較

注：與空白組比較，**P<0.01。

3.2 對(duì)膜性腎病大鼠胸腺和脾臟重量及指數(shù)的影響

由表2可見，與空白組比較，模型組大鼠脾臟重量、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高(P<0.01)，而胸腺重量有升高趨勢(shì)，但無顯著性差異(P>0.05)。與模型組比較，參芪蛭龍湯高劑量組可顯著降低膜性腎病大鼠脾臟重量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)(P<0.01,P<0.05)，而對(duì)胸腺重量有降低趨勢(shì)，但無顯著性差異(P>0.05)。

3.3 對(duì)膜性腎病大鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α含量的影響

由表3可見，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-2含量顯著降低(P<0.01)；TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量和高劑量組IL-2含量均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；參芪蛭龍湯低劑量組TNF-α含量呈下降趨勢(shì)(P>0.05)，參芪蛭龍湯高劑量組TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，空白組、參芪蛭龍湯低劑量組和高劑量組中IL-6含量均無顯著性變化(P>0.05)。

表2 參芪蛭龍湯對(duì)膜性腎病大鼠胸腺和脾臟重量和指數(shù)影響的比較

注：與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05;與空白組比較，#P<0.01。

表3 參芪蛭龍湯對(duì)膜性腎病大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α含量影響的比較

注：與空白組比較,#P<0.01，△P<0.05;與模型組比較，**P<0.01,*P<0.05。

3.4 對(duì)膜性腎病大鼠腎臟病理變化的影響

由圖1所示，空白組大鼠腎臟組織中腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、足突無融合、基底膜均勻、無增厚、上皮下無電子致密物形成。模型組大鼠腎臟組織中腎小球足突廣泛融合或消失、微絨毛形成、基底膜彌漫重度增厚、上皮下大量大塊電子致密物沉積，電子致密物周圍大量基底膜增生。參芪蛭龍湯低劑量組腎臟組織中腎小球足突廣泛融合、基底膜彌漫輕度增厚，少量電子致密物沉積。參芪蛭龍湯高劑量組足突彌漫融合，基底膜僅部分增厚，極少電子致密物沉積。

圖1 參芪蛭龍湯對(duì)膜性腎病大鼠腎組織病理形態(tài)的影響(20 000×)

4 討論

參芪蛭龍湯是在廣泛查閱文獻(xiàn)，總結(jié)歷代醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，反復(fù)遴選，精簡(jiǎn)藥味而成，應(yīng)用臨床多年，療效確切。膜性腎病以脾腎虧虛為本，濕濁瘀血為標(biāo)。方中黨參、黃芪補(bǔ)益脾氣,淫羊藿補(bǔ)益腎陽(yáng)、鼓舞腎氣，為君藥；當(dāng)歸、川芎活血化瘀，水蛭、地龍、僵蠶蟲類入絡(luò)，化瘀消癥為臣藥；虎杖、鳳尾草活血化瘀、利水消腫為佐藥；全方共奏補(bǔ)益脾腎、化瘀利濕之效。黃芪具有降低血液高黏度狀態(tài)，控制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[1]。水蛭中含有水蛭素、肝素和抗血栓素成分，具有抗凝、降低血液黏稠度等作用，可改善腎病綜合征高脂高凝狀態(tài)[2]。當(dāng)歸可以降低血小板聚集、降低血脂，保護(hù)肝臟、利尿、抗炎、抗氧化和清除自由基、抗組織纖維化、改善腎臟組織的血流灌注從而減輕腎組織的缺氧性損傷[3-4]。黨參能調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，使巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，提高網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬能力[5]。虎杖苷可通過抑制腎組織中Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子(Myd88)、核轉(zhuǎn)錄因子KappaB(NF-КB)的表達(dá)，抑制其下游通路炎癥因子IL-6，TNF-α的生成，減少炎癥因子對(duì)腎組織的攻擊損害[6]。

特發(fā)性膜性腎病病理特點(diǎn)是電鏡下腎小球基底膜彌漫性增厚，上皮下電子致密物沉積。這些沉積于上皮下的免疫復(fù)合物來源于循環(huán)中自身抗體與表達(dá)于足細(xì)胞上的內(nèi)源性抗原的結(jié)合[7]，上皮下免疫復(fù)合物沉積和補(bǔ)體激活導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障功能障礙和蛋白尿形成。細(xì)胞因子是由免疫原、絲裂原或其他因子刺激細(xì)胞所產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用。IL-2具有活化T細(xì)胞并促進(jìn)其增殖的作用，IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和分化為抗體產(chǎn)生細(xì)胞，TNF-α通過促使炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放,促進(jìn)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)、以及促進(jìn)前列腺素E2血小板活化因子的合成與釋放,使炎癥細(xì)胞聚集與黏附、微血管擴(kuò)張與通透性增加[8]。TNF-α多由T細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在腎臟疾病發(fā)病中發(fā)揮著重要作用的炎癥介質(zhì)，一方面可對(duì)組織細(xì)胞直接作用，另一方面也會(huì)誘發(fā)其他類型的炎癥介質(zhì)間接地發(fā)揮作用[9]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠比較，膜性腎病大鼠血清中IL-2含量顯著下降。參芪蛭龍湯治療后血清中IL-2含量顯著升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)研究膜性腎病大鼠血清IL-2水平降低，可能與該病免疫力低下有關(guān)。IL-6是參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，正常腎臟細(xì)胞產(chǎn)生微量的IL-6，當(dāng)腎小球細(xì)胞或系膜受到TNF-α刺激后，IL-6分泌可增加，IL-6與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合刺激腎小球系膜細(xì)胞增殖。因而TNF-α和IL-6與增殖性腎小球疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]。本研究中模型組TNF-α水平顯著升高，與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。經(jīng)參芪蛭龍湯治療后，與模型組比較，中藥高劑量組TNF-α水平明顯下降(P<0.05)，中藥低劑量組TNF-α水平呈下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)?？瞻捉M、模型組、中藥高低劑量組IL-6水平均無顯著差異。結(jié)合其他的研究成果發(fā)現(xiàn),PNS可能與炎癥因子 TNF-α、IL-6 升高有關(guān)[10-11]。

腎病綜合征根據(jù)病理類型分為微小病變腎病、系膜增生性腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化、膜型腎病和系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎。以往對(duì)IL-2、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子在腎病綜合征發(fā)病中作用的實(shí)驗(yàn)研究均未明確進(jìn)行病理分型，所以出現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至有些實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相反。本實(shí)驗(yàn)研究針對(duì)膜性腎病大鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，膜性腎病大鼠IL-2水平下降、TNF-α水平升高，IL-6水平未見明顯變化，提示不同病理類型的腎病綜合征，其發(fā)病參與的炎癥因子不同，IL-6未參與膜性腎病的發(fā)病。有實(shí)驗(yàn)研究表明,IL-6作為腎臟系膜細(xì)胞的一種自分泌生長(zhǎng)因子,能夠促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞增多和基質(zhì)增生，且與之呈正相關(guān)[12]。膜性腎病系膜細(xì)胞和基質(zhì)均正常，也說明IL-6未參與膜性腎病的發(fā)病。系膜增生性腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化、系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎系膜細(xì)胞和基質(zhì)均有不同增生，結(jié)合以往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可能參與系膜增生性腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化、系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎的發(fā)病。Horii等[13]研究表明，微小病變腎病(MCNS)和正常人尿中無IL-6活性，可能IL-6未參與微小病變型腎病的發(fā)病。

本次實(shí)驗(yàn)研究表明,參芪蛭龍湯能升高膜性腎病大鼠血清IL-2水平，降低TNF-α水平，提示IL-2和TNF-α可能參與大鼠膜性腎病的發(fā)病，IL-6與大鼠膜性腎病發(fā)病無關(guān)。膜性腎病胸腺和脾臟指數(shù)增大，提示存在異常免疫功能亢進(jìn)。