胡 濤，李 群，劉伯玉

（安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032）

水皰性口炎病毒（VSV）可引起人畜共患疾病，是馬、牛和豬等口腔黏膜、乳頭、皮膚及蹄冠部皮膚出現(xiàn)水泡及糜爛為特征一種病毒性疾病，很少發(fā)生死亡[1]。人可通過與病畜接觸而感染，癥狀類似感冒，一周后康復(fù)并產(chǎn)生中和抗體[2]。根據(jù)VSV可使Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）[3]，本實(shí)驗(yàn)用純化的抗原制備了兔抗VSV多克隆抗體，采用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、中和試驗(yàn)來測(cè)定血清效價(jià)。上述實(shí)驗(yàn)方法是我國(guó)對(duì)病毒性疾病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、疫病診斷、防疫檢測(cè)和免疫程序制訂等工作的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是目前高校醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)中學(xué)生操作的主要內(nèi)容之一[4]，故通過建立實(shí)驗(yàn)教學(xué)檢測(cè)方法的結(jié)果觀察分析，可為課堂教學(xué)、VSV科研及流行病學(xué)調(diào)查提供可靠依據(jù)和技術(shù)保障。

1 材料

1.1 病毒株與細(xì)胞株

VSV毒株、Vero細(xì)胞株均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供。

1.2 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用兔由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.3 試劑

完全佐劑和不完全佐劑由蕪湖天明生物科技有限公司提供，HRP標(biāo)記羊抗兔IgM為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；包被液、抗體稀釋液、顯色液、底物液、終止液、封閉液均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室自制。

1.4 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀（Biotek-EL808）、倒置生物顯微鏡（OLMPCUSCKX41）、CO2孵箱（日本株式社，日本）。

2 方法

2.1 純化VSV抗原的制備

將VSV毒株接種于Vero單層細(xì)胞，DMEM無血清維持液，48小時(shí)細(xì)胞病變（CPE）達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒，4℃凍融3次，30 000 r/min，除去細(xì)胞碎片，上清液按文獻(xiàn)[5]純化抗原。經(jīng)5 000 r/min離心30 min，取上清以30 000 r/min 4℃離心3小時(shí)，棄上清，將沉淀用少量PBS充分懸浮，獲得VSV病毒，測(cè)其濃度及毒力并分裝保存-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 VSV抗原佐劑苗的制備

免疫前分別將弗氏完全佐劑和等量VSV抗原混勻，吸入20 mL注射器內(nèi)，反復(fù)吹吸，直至形成黏稠的乳劑，滴于水上完全不擴(kuò)散，不完全佐劑制備方法同上。

2.3 兔抗VSV多克隆抗體的制備

取體重為2～3 kg雄性、無感染疾患的兔共6只，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)明記號(hào)（a、b、c、d、e、f），實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行健康觀察兩周。免疫前兔耳靜脈采血，分離血清，作為免疫血清陰性對(duì)照。免疫共5周，每周免疫注射家兔一次，第一次免疫VSV中加等量完全佐劑，采用多部位背部皮下注射2 mL VSV抗原，第二次抗原中等量加不完全佐劑，采用多部位腹部皮下注射2 mL VSV抗原，后3次免疫在兔耳靜脈注射1 mL VSV抗原，后一周心臟抽血離心分離血清測(cè)定效價(jià)。

2.4 兔抗VSV多克隆抗體的雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用滅菌1%NaCl溶液將配制成1%瓊脂液，將瓊脂融化，稍冷后傾注于清潔載玻片上，每張載玻片上4～5 mL。正六角形打孔，孔距3～5 mm，孔徑3～4 mm。將瓊脂板標(biāo)明記號(hào)，分別稀釋待測(cè)血清原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。加樣：中央加1∶2的VSV抗原。其他6孔注入上述不同稀釋度免疫血清VSV。靜置：將上述瓊脂板平置于一個(gè)墊有濕紗布的盒內(nèi)，于室溫24～48小時(shí)觀察結(jié)果。

2.5 兔抗VSV多克隆抗體的間接ELISA法

將上述純化VSV抗原，加96孔酶標(biāo)板中做方陣滴定，獲合適濃度，用pH 9.6碳酸緩沖液包被抗原，設(shè)正常抗原孔，每孔75 μL，4℃過夜，10%牛血清封板1小時(shí)后，洗滌甩干備用。待測(cè)免疫血清分別按1∶10不同濃度倍比稀釋，每孔75 μL，放置37℃1小時(shí)，洗滌3次后，二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔IgM，用封板液稀釋1∶5 000，每孔75 μL，37℃ 1小時(shí)后洗滌3次。顯色：TMB A液及B液每孔各25 μL，與正?？乖妆容^，一般正?？乖撞伙@色，其他顯藍(lán)色為陽(yáng)性。以未免疫血清作為陰性對(duì)照，以待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照OD值（P/N）2.1作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)最高稀釋度作為該血清的抗體效價(jià)（滴度）。

2.6 兔抗VSV多克隆抗體的中和試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)

實(shí)驗(yàn)前將預(yù)先被檢血清（a、b、c、d、e、f）和陰性對(duì)照血清于56℃滅活30 min。方法：將血清在微量細(xì)胞培養(yǎng)板上以2倍系列稀釋，血清稀釋從1∶4開始，每份血清使用兩排孔，第1孔加入100 μL，稀釋至第8孔吸出100 μL棄去。第9孔細(xì)胞對(duì)照，第10孔病毒對(duì)照，均不加血清，預(yù)先按文獻(xiàn)[6]配100TCID50VSV病毒懸液，按每孔100 μL加入，C細(xì)胞對(duì)照及血清S對(duì)照（即第1、9孔）不加病毒，V病毒對(duì)照加100TCID50100 μL。每孔總量200 μL，C對(duì)照及S對(duì)照補(bǔ)充稀釋液100 μL/孔。37℃ 1小時(shí)，分別將1×106/mL Vero細(xì)胞懸液100 μL加入每孔，37℃ CO2孵育，48小時(shí)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 VSV病毒的純化

將細(xì)胞培養(yǎng)的VSV用超速離心純化后，紫外分光光度計(jì)測(cè)其蛋白濃度為3.08 mg/mL。VSV接種Vero細(xì)胞的感染滴度為10-5/0.1 mL。

3.2 VSV抗原免疫接種后兔臨床癥狀

觀察兔發(fā)病，出現(xiàn)腹瀉、消瘦、食欲減退或不食等癥狀。唇、口腔黏膜等處出現(xiàn)水皰，水皰破潰，形成爛斑，局部的皮膚發(fā)生炎癥和脫毛。

3.3 兔抗VSV多克隆抗體的雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

觀察中間孔為VSV抗原，周圍孔為不同稀釋的免疫血清抗體，以出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋為抗體效價(jià)，出現(xiàn)沉淀帶完全融合證明同種抗原，二者有部分相連表明二者有共同抗原決定簇，兩條沉淀線相互交叉說明二者抗原完全不同，結(jié)果見圖1。免疫血清檢測(cè)抗體效價(jià)結(jié)果分別為：a為1∶16、b為1∶16、c為 1∶32、d 為 1∶16、e 為 1∶16、f為 1∶32。

3.4 兔抗VSV多克隆抗體的ELISA法

兔抗VSV做方陣滴定的最佳工作濃度為1∶800（5.16wg/mL）；酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1∶5 000，6組VSV免疫血清IgM檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 VSV-雙向瓊脂擴(kuò)散和ELISA及中和抗體試驗(yàn)的結(jié)果比較

3.5 兔抗VSV多克隆抗體的中和試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)

用倒置生物顯微鏡觀察結(jié)果，首先觀察對(duì)照：V對(duì)照（＋＋＋＋）、S對(duì)照（－/＋－）、C 對(duì)照（－），以病變作為指標(biāo)，能抑制病毒CPE的血清最高稀釋度為中和抗體效價(jià)（滴度）。6組VSV免疫血清中和試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)結(jié)果見表2、圖2。

表2 6組VSV免疫血清中和試驗(yàn)CPE測(cè)定效價(jià)結(jié)果觀察

圖2 中和試驗(yàn)（A細(xì)胞對(duì)照；B VSV滴度；C血清對(duì)照；D病毒對(duì)照）

3.6 兔抗VSV多克隆抗體實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果的分析比較

6份血清中，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和間接ELISA與病毒中檢測(cè)結(jié)果相符，見表1。其中雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)出現(xiàn)沉淀帶完全融合證明同種VSV抗原，中和試驗(yàn)結(jié)果顯示病毒回歸成立，正常對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)良好。觀察VSV免疫血清中和效價(jià)和間接ELISA效價(jià)，通過結(jié)果可見這兩種方法檢測(cè)血清的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照是一致的。

4 討論

上述實(shí)驗(yàn)證明，兔可被VSV感染導(dǎo)致出現(xiàn)臨床癥狀，可用來研究病毒致病性與實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的關(guān)系。研究表明，實(shí)驗(yàn)采用純化的全病毒免疫兔，可獲得抗VSV所有結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，而抗體的效價(jià)和純度是影響ELISA敏感性的因素[7]，因此，對(duì)抗VSV進(jìn)行了純化，最大可能地降低了非特異性反應(yīng)，從而提高了敏感性。純化VSV能夠被兔抗VSV陽(yáng)性血清阻斷，而不被兔抗VSV陰性血清阻斷，雙向瓊脂擴(kuò)散和ELISA及中和抗體試驗(yàn)的方法，表明該方法在檢測(cè)其他相關(guān)病毒時(shí)不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性良好。

建立上述實(shí)驗(yàn)方法是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)不同專業(yè)學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)課的主要內(nèi)容之一，包括高校八年制本博連讀學(xué)生臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)開設(shè)“病毒分離培養(yǎng)、鑒定及血清流行病調(diào)查”，研究生開設(shè)“細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與傳染病預(yù)防診斷”，衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生開設(shè)“動(dòng)物免疫血清的制備與檢測(cè)方法”實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容，通過這些實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容，學(xué)生可以通過這些實(shí)際操作觀察分析病毒的免疫學(xué)檢測(cè)方法結(jié)果，使本科生和研究生更好地熟悉和掌握傳染病的診斷、治療和預(yù)防等教學(xué)實(shí)踐性內(nèi)容，也可為血清學(xué)的檢測(cè)提供依據(jù)。