馬樓艷，李 洺，翟佳佳，呂雅麗，成蕊寧

西安市第九醫(yī)院 老年病二科(西安 710054)

全球糖尿病患者人數(shù)迅猛增長，已成為中國重要的民生健康問題。糖尿病對其他疾病的影響也日益受到重視。目前，糖尿病已被視為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD )的獨立危險因素[1]，故明確糖尿病促進AD發(fā)病的機制，有利于早期預(yù)防AD的發(fā)生發(fā)展。前期研究[2]發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬部位存在自噬的激活，但是自噬流不通，溶酶體功能出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致Aβ清除障礙，海馬神經(jīng)元凋亡增加。前額葉和海馬均是大腦參與學(xué)習(xí)與記憶的重要部位，既往研究[3]發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠前額葉部位存在Aβ蛋白沉積，但糖尿病大鼠前額葉部位自噬水平的情況目前鮮有報道。本實驗采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，研究糖尿病大鼠成模第8、10、12周時的認知功能，前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)以及前額葉部位Aβ和自噬指標(biāo)的表達情況，探討糖尿病促進認知障礙發(fā)生的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

鏈脲佐菌素(STZ),Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)，兔抗Aβ大鼠多克隆抗體(Abcame)，兔抗大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62抗體，Trizol(TAKARA)，Real-time PCR擴增反應(yīng)體系(TAKARA)，引物設(shè)計及合成(上海生工生物工程有限公司合成)(表1)。

表1 各引物序列

1.2 方法

1.2.1 動物 SPF級SD雄性大鼠90只，8～10周齡，體重180～200 g(西安交通大學(xué)動物實驗中心)。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為正常組(n=45)和糖尿病組(n=45)。建立經(jīng)典的STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型：所有大鼠禁食12 h后，糖尿病組大鼠腹腔注射1%的STZ(65 mg/kg)，正常對照組腹腔注射等劑量生理鹽水，3 d后測大鼠尾靜脈空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L，提示模型建立成功。

1.2.2 Morris水迷宮測試 分別于成模后第7、9、11周，訓(xùn)練3 d，第4天進行隱藏平臺獲得實驗，分析潛伏期，考察學(xué)習(xí)能力。第5天撤去平臺進行空間搜索實驗，去除平臺觀察2 min內(nèi)大鼠穿越中心區(qū)域的次數(shù)，測試記憶能力。

1.2.3 電鏡觀察 水迷宮測試結(jié)束后，每組取出5只大鼠，深度麻醉大鼠，采用心臟灌流的方法，留取大鼠前額葉標(biāo)本，固定。標(biāo)本制作良好后，在電鏡下觀察不同時期各組大鼠前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 qRT-PCR 抽提前額葉組織的總RNA，按照PrimeScirpt RT Master Mix試劑盒說明書進行，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；進一步按照SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒說明書建立實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)進行實時熒光檢測，最末循環(huán)作熔鏈曲線分析。實驗引物委托上海生工生物科技有限公司設(shè)計合成(表1)。

1.2.5 Western blot 提取前額葉組織總蛋白，將動物組織放置于1.5 mL的EP管中，進行裂解，用BCA法測定蛋白濃度，完成配置凝膠，上樣，電泳，染色，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別孵育一抗、二抗，發(fā)光，顯影，攝像等過程。進行條帶灰度值分析及統(tǒng)計分析。

1.2.6 免疫組化 采用SP法免疫組織化學(xué)染色，處死大鼠，1%甲醛心臟灌注取腦，石蠟包埋連續(xù)切片，根據(jù)試劑盒說明檢測Aβ、Beclin-1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ在大鼠前額葉部位的表達。具體步驟如下：常規(guī)石蠟切片脫蠟，高壓鍋煮沸修復(fù)抗原，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，正常山羊血清封閉，滴加一抗過夜，37 ℃孵育1 h，加入山羊抗兔IgG、SP復(fù)合物，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，以陽性產(chǎn)物是棕黃色為度。蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察照相。每個標(biāo)本隨機選取3張切片，每張切片高倍鏡下隨機選取3個視野，采用ImageJ 6.0軟件測定該區(qū)域Aβ、Beclin-1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ陽性染色神經(jīng)元的平均吸光度值，取其平均吸光度值作為結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試結(jié)果

2.1.1 隱藏平臺獲得實驗 與正常組大鼠比較，糖尿病組大鼠自第8周開始，出現(xiàn)逃避潛伏期增加(P<0.05)，且隨著時間的延長，第10周和第12周糖尿病大鼠逃避潛伏期較正常對照組均延長(P<0.001)(表2)。

2.1.2 空間搜索實驗 與正常組大鼠相比，自第8周始糖尿病組大鼠穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)明顯下降(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠在成模第8、10、12周時Morris水迷宮成績

2.2 電鏡結(jié)果

4 000倍電鏡下可見糖尿病組大鼠前額葉神經(jīng)元細胞間隙增寬，細胞水腫明顯。40 000倍電鏡下可見神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器結(jié)構(gòu)模糊不清，核質(zhì)固縮碎裂(圖1)。

圖1 電鏡觀察各組大鼠前額葉部位超微結(jié)構(gòu)

注：A：正常組大鼠第8周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000)；B：糖尿病組大鼠第8周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000)；C：糖尿病組大鼠第10周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000)；D：糖尿病組大鼠第12周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000)；E：正常組大鼠第8周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000)；F：糖尿病組大鼠第8周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000)；G：糖尿病組大鼠第10周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000)；H：糖尿病組大鼠第12周時前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000)

2.3 qRT-PCR檢測結(jié)果

與正常組大鼠對比，第8周糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ前體(amyloid precursor protein，APP)mRNA表達升高(P=0.037),Beclin-1 mRNA表達水平升高(P=0.008)。LC3Ⅰ mRNA在第8周和第10周時與正常組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，到第12周時表達水平明顯下降(P=0.001)。LC3ⅡmRNA第8周時與正常組相比，表達水平升高(P=0.028)，在第10周和第12周時表達水平均升高(P=0.011和P=0.019)(圖2～3)。

圖2Westernblot、免疫組化及qRT-PCR檢測大鼠前額葉神經(jīng)元Aβ、APPmRNA表達情況

注：A：qRT-PCR檢測各組大鼠前額葉APP mRNA的表達；B： Western blot檢測各組大鼠前額葉Aβ水平灰度值；C：免疫組化檢測各組大鼠前額葉Aβ水平的光密度值。與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與糖尿病組第8周比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001

圖3 Western blot、免疫組化及qRT-PCR檢測各組大鼠前額葉神經(jīng)元相關(guān)蛋白、mRNA表達情況

注：A：各組大鼠前額葉部位Beclin-1 mRNA表達情況；B： Western blot檢測各組大鼠前額葉部位Beclin-1灰度值; C：免疫組化檢測各組大鼠前額葉部位Beclin-1的光密度值；D：各組大鼠前額葉部位LC3Ⅰ mRNA表達情況; E：各組大鼠前額葉部位LC3ⅡmRNA表達情況；F：Western blot檢測各組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/ Ⅰ灰度值比值；G：免疫組化檢測各組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ的光密度值比值；H：Western blot檢測各組大鼠前額葉部位p62灰度值。與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與糖尿病組第8周比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001

2.4 Western blot結(jié)果

與正常組大鼠相比，糖尿病組大鼠第8周時Aβ蛋白表達明顯升高(P=0.005)，第10周時Aβ蛋白表達較正常組升高(P=0.021)，且高于第8周時糖尿病組的水平(P=0.035)，第12周時Aβ蛋白表達升高明顯(P=0.011)，同樣也高于第8周時糖尿病大鼠的表達水平(P=0.008)。且隨著時間延長，Aβ蛋白表達逐漸升高(r2=0.961,P<0.001)。第8周時糖尿病大鼠前額葉部位Beclin-1蛋白表達升高(P=0.035)，第10周時Beclin-1蛋白表達同樣升高(P=0.005)，第12周時Beclin-1蛋白表達與正常組相比升高更為明顯(P<0.001)。LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白灰度值比較結(jié)果顯示，第8周時糖尿病組大鼠前額葉部位LC3 Ⅱ/Ⅰ比值較正常組升高(P=0.005)，到第10周時LC3 Ⅱ/Ⅰ比值較正常組升高(P=0.003)，且高于第8周時LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(P=0.008)，第12周時糖尿病組大鼠LC3 Ⅱ/Ⅰ比值明顯高于正常組大鼠(P<0.001)，且明顯高于第8周時糖尿病組的水平(P<0.001)。兩組大鼠前額葉部位p62蛋白水平在第8、10、12周時表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3～4)。

圖4Westernblot檢測各組大鼠前額葉神經(jīng)元相關(guān)蛋白的表達情況

2.5 免疫組化結(jié)果

2.5.1 Aβ陽性細胞表達 與正常組大鼠相比，糖尿病大鼠前額葉部位自第8周始可見大量的Aβ陽性細胞，光密度值明顯高于正常組(P=0.008)，第10周時前額葉部位Aβ陽性細胞的光密度值高于正常組(P=0.004)，且同樣高于第8周時Aβ表達(P=0.005)。第12周時糖尿病組Aβ陽性細胞的光密度值明顯高于正常組(P=0.003)，也高于第8周時糖尿病組Aβ的表達(P<0.001)。且隨著糖尿病病程延長，Aβ陽性細胞數(shù)目明顯增加(r2=0.960，P<0.001)(圖2、圖5)。

圖5 免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經(jīng)元Aβ的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.2 Beclin-1陽性細胞表達 第8周時與正常組大鼠相比，糖尿病大鼠前額葉部位可見大量的Beclin-1陽性細胞，光密度值明顯高于正常組(P=0.005)；第10周時前額葉部位Beclin-1陽性細胞的光密度值高于正常組(P=0.003)，且同樣高于第8周時Beclin-1的表達(P=0.004)。第12周時糖尿病組Beclin-1陽性細胞的光密度值明顯高于正常組(P<0.001)，也高于第8周時糖尿病組Beclin-1的表達(P<0.001)(圖3、圖6)。

圖6免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經(jīng)元Beclin-1的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.3 LC3Ⅰ陽性細胞的表達 與正常組大鼠相比，糖尿病大鼠前額葉部位在第8、10、12周時可見LC3Ⅰ陽性細胞數(shù)量減少(圖7)。

圖7免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經(jīng)元LC3Ⅰ的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.4 LC3Ⅱ陽性細胞的表達 與正常組大鼠相比，第8、10、12周時糖尿病大鼠前額葉部位可見大量的LC3Ⅱ陽性細胞(圖8)。LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白光密度值的比值顯示：第8周時，糖尿病大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ比值高于正常組(P=0.005)，第10周時同樣高于正常組(P=0.027)，但較第8周時LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.078；第12周時糖尿病組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ光密度比值高于正常組(P=0.031)，同樣高于第8周時糖尿病組LC3Ⅱ/Ⅰ光密度比值(P=0.041)(圖3)。

圖8免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經(jīng)元LC3Ⅱ的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.5 Aβ表達水平與自噬相關(guān)蛋白表達的相關(guān)性Western blot檢測蛋白灰度值的結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ表達與Beclin-1表達呈正相關(guān)(r2=0.671 0,P<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示，Aβ表達與Beclin-1表達呈正相關(guān)(r2=0.955 8,P<0.001)；Western blot檢測蛋白灰度值的結(jié)果顯示，Aβ表達與LC3Ⅱ/Ⅰ的比值呈正相關(guān)(r2=0.799 2,P<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示，Aβ表達與LC3Ⅱ/Ⅰ的比值表達呈正相關(guān)(r2=0.889 1,P<0.001)(圖9)。

圖9糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ與自噬相關(guān)蛋白表達的相關(guān)性

注：A：Western blot結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與LC3Ⅱ/ Ⅰ灰度值的相關(guān)性；B：Western blot結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與Beclin-1灰度值的相關(guān)性；C：免疫組化結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與Beclin-1光密度值的相關(guān)性；D：免疫組化結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與LC3Ⅱ/ Ⅰ光密度值的相關(guān)性

3 討論

自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分，形成自噬體或自噬液泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，完成對包裹物質(zhì)的降解和循環(huán)再利用。自噬在細胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起重要作用。自噬抑制后導(dǎo)致變性蛋白和失能細胞器等清除延遲以及異常蓄積，從而誘發(fā)相應(yīng)的病理過程[4-5]。AD患者腦內(nèi)存在Aβ的過度聚集，最近研究[6]顯示，自噬是降解和清除異常聚集蛋白的主要機制。國外眾多學(xué)者研究[7]發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠成模第8周時即出現(xiàn)認知功能下降，而且糖尿病大鼠成模第14周后的死亡率增加，故選取在成模第8、10、12周作為檢測糖尿病大鼠的行為學(xué)和相關(guān)指標(biāo)的時間點。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在成模第8周時Morris水迷宮測試結(jié)果可見潛伏期延長，穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)減少，表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)能力下降，提示糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯認知功能障礙，這與國外研究結(jié)果一致。Aβ不能清除或者降解時，在腦內(nèi)聚集并纖維化，進一步形成老年斑，這是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和重要病理學(xué)基礎(chǔ)。前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬及前額葉神經(jīng)元部位Aβ蛋白沉積，合并認知障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，前額葉神經(jīng)元可見Aβ沉積，同時伴有自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，提示自噬激活。通常情況下，自噬水平激活，p62水平下降，清除異常聚集蛋白能力增加。但在本研究中，p62表達水平不變，同時Aβ沉積未改善，且Aβ表達與自噬相關(guān)蛋白的表達呈正相關(guān)性，提示可能自噬體包裹Aβ蛋白后，自噬流不通，導(dǎo)致Aβ清除障礙，大量Aβ沉積，進一步加重神經(jīng)系統(tǒng)的損害，導(dǎo)致認知功能障礙。自噬體包裹異常蛋白后，會與溶酶體融合進一步消化分解，故推測自噬流不通的原因可能與溶酶體功能異常相關(guān)，導(dǎo)致蛋白聚集后的清除障礙。這需要進一步研究前額葉部位的溶酶體功能來明確，也是下一步研究重點。