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        北京市腹瀉兒童人博卡病毒VP1區(qū)基因特征分析

        2019-03-13 02:16:28吉彥莉王永全崔海洋
        傳染病信息 2019年1期
        關(guān)鍵詞:北京地區(qū)進化樹相似性

        吉彥莉,王永全,崔海洋,靳 博

        感染性腹瀉是全球兒童常見傳染病,是5歲以下兒童死亡的第二大原因。在我國,感染性腹瀉的發(fā)病率一直位居腸道傳染病的首位,疾病負擔(dān)嚴重[1-3],已納入《中華人民共和國傳染病防治法》管理。研究表明,病毒是引起嬰幼兒感染性腹瀉的最主要原因,其中,諾如病毒、輪狀病毒、腸道腺病毒和星狀病毒是4種最常見的致瀉病毒[4-5],同時也是病毒性腹瀉常規(guī)監(jiān)測項目。但是,仍有近50%的兒童急性腹瀉病原不明確[6-8]。

        人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)是瑞典學(xué)者Allander于2005年發(fā)現(xiàn)的一種細小病毒[9],是單正鏈無包膜DNA病毒,基因組全長約5.6 kb,目前共發(fā)現(xiàn)4種型別(HBoV1~4型)。因HBoV在急性腹瀉糞便中頻繁檢出[10-12],引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,多項病例對照研究都證明了其與腹瀉的相關(guān)性[13-14]。作為一種新發(fā)腹瀉相關(guān)病毒,

        HBoV尚未被納入常規(guī)腹瀉病原學(xué)監(jiān)測,相關(guān)研究在我國亦不多見。本研究通過對北京地區(qū)急性腹瀉兒童HBoV的感染狀況及基因進化特征的研究,為兒童病毒性腹瀉的防控提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 資料來源 2015年11月 2016年12月,采集哨點醫(yī)院(北京大學(xué)第一醫(yī)院、北京市兒童醫(yī)院)門診就診的急性腹瀉兒童糞便標(biāo)本?;純耗挲g<5歲,發(fā)病時間<3 d,就診主訴為嘔吐或腹瀉等消化道癥狀。

        1.2 標(biāo)本前處理 將糞便標(biāo)本與PBS充分震蕩混勻,制成10%的糞便懸液,8000 rpm離心5 min,取上清液備用。

        1.3 HBoV檢測 用QIAamp? MinElute Virus Spin Kit(Qiagen)提取病毒核酸,通過巢式PCR擴增HBoV VP1區(qū)部分序列,引物序列見表1,反應(yīng)條件參照文獻[13]。目的片段條帶為567 bp,用QIAxcel Advanced毛細管電泳進行檢測。PCR陽性產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行純化回收及序列測定。

        1.4 HBoV進化分析 將測序結(jié)果通過 BLAST比對確定病毒型別。下載Genbank中不同型別和亞型、不同地域及不同時間分布的HBoV序列,作為參考序列。用 Vector NTI AlignX計算毒株間序列相似性。用MEGA7進行序列和進化分析,用鄰接法構(gòu)建進化樹,用Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離。

        表1 HBoV巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers for HBoV

        2 結(jié) 果

        2.1 腹瀉兒童基本情況 2015年11月 2016年12月,共收集到396例5歲以下腹瀉兒童糞便標(biāo)本。患兒中,男223例,女173例,男女比例為1.29∶1。患兒最大月齡58個月,最小為0個月,月齡中位數(shù)為12個月。

        2.2 HBoV的檢出情況 共檢出HBoV 30例,總檢出率為7.58%。其中,HBoV1型檢出17例,檢出率為4.29%;HBoV2型檢出11例,檢出率為2.78%;HBoV3型檢出2例,檢出率為0.51%,未檢出HBoV4型。

        2.3 HBoV序列分析 將30例HBoV北京株(基因型別為:HBoV1、HBoV2及HBoV3)VP1區(qū)序列與Genbank中的序列進行BLAST比對。序列分析顯示30例HBoV北京株在VP1區(qū)核苷酸序列相似性為71%~100%,氨基酸序列相似性為85%~100%。其中,17例HBoV1北京株序列相似性為96%~100%,與HBoV1參考序列相似性為98%~99%;11例HBoV2北京株序列之間相似性為96%~100%,與HBoV2參考序列相似性為91%~99%;2例HBoV3北京株序列相似性為99%,與HBoV3參考序列相似性為97%~98%。

        2.4 HBoV分子進化分析 系統(tǒng)進化樹顯示,HBoV包括4個進化樹分支,分別為HBoV1、HBoV2、HBoV3和HBoV4。本研究中的所有序列均位于HBoV1~3型分支上(圖1)。其中,HBoV1型北京株分支包括兩簇:BJ16-325自成一簇,與其他HBoV1型序列差異達4%;其余HBoV1型序列高度同源(相似性為98%~99%),共同構(gòu)成一簇。HBoV1 VP1區(qū)氨基酸序列比對分析也表明,BJ16-325與其他HBoV1型北京株相比,氨基酸特異變化位點最多,為4個(圖2),表明BJ16-325出現(xiàn)了較高程度的變異。

        既往國內(nèi)外報道將HBoV2分型為HBoV2A和HBoV2B 2個亞型。而本研究顯示,HBoV2型序列在進化樹上包括3個亞型分支(bootstrap>90),本研究中所有HBoV2型北京株序列均獨立于HBoV2A和HBoV2B亞型,位于一個新的亞型分支上。同源性分析表明,本研究中的HBoV2型北京株與HBoV2A、HBoV2B亞型間相似性分別為91%~93%及92%~93%,低于HBoV2A和HBoV2B亞型間的相似性(95%~96%)。此外,通過kimura-2-parameter模型計算遺傳距離發(fā)現(xiàn),該HBoV2北京株序列與HBoV2A、HBoV2B亞型參考序列間平均遺傳距離分別為0.079和0.081,均高于2A與2B亞型之間的平均遺傳距離(0.045),由此表明該HBoV2型北京株序列為HBoV2的一個新的亞型。

        圖1 北京地區(qū)HBoV生物進化樹Figure 1 Phylogenetic tree of HBoV in Beijing

        3 討 論

        嬰幼兒是急性感染性腹瀉的高發(fā)人群,發(fā)病率和病死率高,是值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。2005年Allander首次發(fā)現(xiàn)了HBoV,之后不斷有學(xué)者從腹瀉糞便中檢出HBoV。本研究顯示,北京地區(qū)5歲以下急性腹瀉兒童HBoV檢出率為7.58%,與重慶、上海等地結(jié)果相似[15-16]。因時間、地域、人群免疫力及檢測方法等不同,HBoV檢出率可出現(xiàn)較大差別[17-18]。

        圖2 HBoV1北京株VP1區(qū)部分氨基酸序列比對Figure 2 Amino acid sequence alignment of partial VP1 region of HBoV1 Beijing strains

        HBoV包括HBoV1~4 4種基因型,其中HBoV3型和HBoV4型檢出率低,較為少見。本研究中檢出的HBoV北京株包括HBoV1、HBoV2和HBoV3 3種型別。從進化樹上可以看到,北京地區(qū)的1株HBoV1序列BJ16-325在進化樹上自成一簇,且與HBoV1其他序列變異程度相對較大,差異達4%。而Zhao等[19]對當(dāng)?shù)剡B續(xù)8年腹瀉病例HBoV的進化研究表明:HBoV1在VP1區(qū)高度保守,8年間所有HBoV1毒株在VP1區(qū)的變異僅為1%。這表明北京地區(qū)至少存在2組不同來源HBoV1毒株的流行。此外,值得注意的是,以往國內(nèi)外報道將HBoV2分為HBoV2A和HBoV2B 2個亞型。而本研究中檢出的所有北京地區(qū)HBoV2序列均不屬于HBoV2A和HBoV2B亞型,而是位于一個新的HBoV2亞型分支上,表明北京地區(qū)HBoV2流行株為近年來出現(xiàn)的一種新的亞型。

        有研究表明,HBoV存在型間重組[20],Zhao等[19]報道了HBoV2A和HBoV2B存在亞型間重組。病毒序列重組可導(dǎo)致新的型別及亞型的出現(xiàn),還可能導(dǎo)致病毒毒力及抗原性的改變。本研究中,北京地區(qū)流行的HBoV2毒株為一個新的亞型,其是否來源于HBoV序列的重組變異還須要進一步研究。

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