魯 宏 宋 俊 孟京紅 李 俊

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院骨科,襄陽441000)

骨關(guān)節(jié)炎是一種與軟骨及其周圍組織有關(guān)的常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，其進(jìn)展通常較緩慢。骨關(guān)節(jié)炎患者在髖部和膝部的運(yùn)動過程中往往會產(chǎn)生很大的負(fù)擔(dān)，這些大型負(fù)重關(guān)節(jié)的疼痛和僵硬往往會導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾，最后需要進(jìn)行外科手術(shù)來治療[1]。隨著預(yù)期壽命的增加，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率將不斷上升。骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并伴隨著巨大的醫(yī)療保健和社會經(jīng)濟(jì)成本。據(jù)統(tǒng)計，在中國香港和加拿大骨關(guān)節(jié)炎患者每年的直接花費(fèi)分別為9 147美元和2 878美元，間接花費(fèi)分別為864美元和9 847美元[2]。開發(fā)新的有效的骨關(guān)節(jié)炎治療方法對醫(yī)療衛(wèi)生健康系統(tǒng)和社會經(jīng)濟(jì)具有重要意義。許多植物在骨關(guān)節(jié)炎的治療方面發(fā)揮著積極作用，如紫草、甘菊藍(lán)、接骨木及洋甘菊等[3,4]。香葉木素(Diosmetin,Diosm)(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1 )發(fā)現(xiàn)于金合歡樹莢果和橄欖樹葉，具有抗癌、殺菌及抗氧化等活性[5]。但目前關(guān)于香葉木素在骨關(guān)節(jié)炎中的作用研究還十分有限。本文主要目的是研究香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物 香葉木素購自北京索萊寶科技有限公司，貨號與規(guī)格： SD8390-20 mg，HPLC ≥98%，用DMSO配制成20 μmol/L。IL-1β來源于Sigma公司，貨號與規(guī)格： SPR3083-10 μg，HPLC ≥98%，用PBS配制成50 ng/ml。

1.1.2動物及細(xì)胞分組 SD大鼠(出生5 d)購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。軟骨細(xì)胞分為4組：對照組，香葉木素組，IL-1β模型組，Diosm+IL-1β處理組。IL-1β模型組和Diosm+IL-1β處理組用IL-1β(50 ng/ml)處理1 h后進(jìn)行換液，香葉木素組和Diosm+IL-1β處理組用含香葉木素(20 μmol/L)的培養(yǎng)液處理48 h；對照組用含DMSO的培養(yǎng)液處理。

圖1 香葉木素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.1.3試劑 DMEM-F12培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific,11320-033)。胎牛血清(Thermo Fisher Science,10099158)。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen,556547)。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的ELISA檢測試劑盒(MSK,69-98069)。一氧化氮(Nitric oxide,NO)的ELISA檢測試劑盒(MSK,69-20148)。前列腺素E2(Prostaglandin E 2,PGE2)的ELISA檢測試劑盒(MSK,69-80119)。抗Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)(Abcam,ab34712)抗體。抗基質(zhì)金屬蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13,MMP-13)(Abcam,ab39012)抗體。抗蛋白聚糖(Abcam,ab2501)抗體?？筃F-κB P65(Abcam,ab16502)抗體?？筽-NF-κB P65(Abcam,ab86299)抗體。

1.2方法

1.2.1軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 新生頸椎脫臼處死后，無菌條件下取出膝關(guān)節(jié)剝離軟骨組織，剪碎至0.5～1 mm3，PBS清洗后離心，1 000 r/min,5 min。再加入0.25%的胰酶37℃消化1 h后離心，1 000 r/min,5 min。去上清，加入含5%胎牛血清的0.2%Ⅱ型膠原酶37℃消化4～5 h。200目篩網(wǎng)過濾后離心，1 000 r/min,5 min。去上清，PBS清洗后加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基制成1×105個/ml 單細(xì)胞懸液。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后更換培養(yǎng)液。按照細(xì)胞分組用IL-1β 和香葉木素處理細(xì)胞后觀察細(xì)胞形態(tài)并統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量。對照組細(xì)胞增殖率設(shè)置為100%。其他各處理組細(xì)胞增殖率=(處理組實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)-處理組初始培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù))/(對照組實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)-對照組初始培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 首先將待測細(xì)胞用1×的Binding buffer制成1×106個/ml的懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min。最后利用流式細(xì)胞儀對染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.3蛋白印跡 用PBS將待測細(xì)胞清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，100℃變性5 min。等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h，再加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，第2天加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達(dá)量。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)物上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測，首先樣品加入反應(yīng)孔后37℃孵育45 min，洗滌液洗滌后加入生物素標(biāo)記的抗體37℃反應(yīng)30 min。然后加鏈霉親和素-HRP 混勻37℃反應(yīng)30 min，再加入顯色劑避光顯色15 min。最后加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測吸光值。

1.2.5免疫熒光 當(dāng)各組待測細(xì)胞長至80%時棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次后用4%的多聚甲醛固定10 min。PBS洗3次后用0.3%的triton-100通透10 min。PBS漂洗3次進(jìn)行封閉，然后加入相應(yīng)的一抗37℃孵育1.5 h，PBS漂洗后加入對應(yīng)的二抗，37℃孵育45 min。滴加DAPI后指甲油封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目的影響 倒置顯微鏡下觀察到，對照組和香葉木素組細(xì)胞形態(tài)正常，呈長梭狀，十分密集；IL-1β組細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常，呈扁平狀，十分稀疏；Diosm+IL-1β組細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，呈長梭狀，較密集(圖2A)。由圖2B可知，對照組和香葉木素組細(xì)胞數(shù)目無明顯差異。IL-1β組細(xì)胞數(shù)目明顯低于對照組(P<0.05)。Diosm+IL-1β組細(xì)胞數(shù)目明顯多于IL-1β組(P<0.05)。由此可見，香葉木素可改善IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞變形及細(xì)胞數(shù)目的下降。

圖2 IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)(A)及細(xì)胞增殖率(B)

2.2香葉木素可降低IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡增加 流式細(xì)胞術(shù)分析香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響。如圖3所示，對照組和香葉木素組細(xì)胞凋亡率無明顯差異。IL-1β組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與IL-1β組相比，Diosm+IL-1β組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)。上述結(jié)果表明，香葉木素會抑制IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的增加。

2.3香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的影響 通過蛋白印跡檢測Ⅱ型膠原、MMP-13和蛋白聚糖蛋白水平，分析香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的影響。圖4顯示，IL-1β組Ⅱ型膠原和蛋白聚糖蛋白水平明顯低于對照組，MMP-13 蛋白水平明顯高于對照組(P<0.05)。與IL-1β組相比，Diosm+IL-1β組Ⅱ型膠原和蛋白聚糖蛋白水平明顯升高，MMP-13 蛋白水平明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果說明，香葉木素可減弱IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白聚糖蛋白水平的降低和MMP-13 蛋白水平的升高。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

圖4 蛋白印跡檢測細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5 ELISA檢測炎癥因子水平

圖6 蛋白印跡檢測NF-κB通路相關(guān)蛋白水平

2.4香葉木素可減弱IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的升高 利用ELISA檢測IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NO、PGE2和TNF-α水平，分析香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。由圖5可知，IL-1β組NO、PGE2和TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.05)。Diosm+IL-1β組NO、PGE2和TNF-α水平明顯低于IL-1β組(P<0.05)。由此可見，香葉木素會抑制IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NO、PGE2和TNF-α的上升，減輕炎癥反應(yīng)。

2.5香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為探究香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NF-κB通路的影響，蛋白印跡檢測NF-κB P65和p-NF-κB P65蛋白水平。如圖6所示，IL-1β組p-P65/P65明顯高于對照組(P<0.05)。Diosm+IL-1β組p-P65/P65明顯低于IL-1β組(P<0.05)。上述結(jié)果說明，香葉木素可降低IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞P65磷酸化水平的升高。

圖7免疫熒光染色觀察NF-κBP65細(xì)胞定位

Fig.7CellularlocalizationofNF-κBP65wasobservedbyimmunofluorescencestaining

Note: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs IL-1β group.

2.6香葉木素會抑制IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NF-κB P65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn) 通過免疫熒光染色觀察香葉木素對IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NF-κB P65細(xì)胞定位的影響。由圖7可知，IL-1β組P65大部分分布在細(xì)胞核中，平均每個細(xì)胞核內(nèi)P65+數(shù)量明顯多于對照組(P<0.05)。Diosm+IL-1β組細(xì)胞核中P65的分布相對變少，平均每個細(xì)胞核內(nèi)P65+數(shù)量明顯少于IL-1β組(P<0.05)。由此可見，香葉木素會降低IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NF-κB P65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制NF-κB通路的活化。

3 討論

目前對骨關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)治療手段主要包括物理治療和止痛藥，不同程度的骨關(guān)節(jié)炎需選擇不同的方法[6]。對輕度骨關(guān)節(jié)炎患者，用對乙酰氨基酚可減輕疼痛感，但它不能降低炎癥，且長期服用會導(dǎo)致肝損傷；對中度骨關(guān)節(jié)炎患者，用非甾體類抗炎藥可以止痛也可減輕炎癥，但長期服用會引起消化不良，心血管問題、胃出血及腎臟和肝臟損傷等。對重度骨關(guān)節(jié)炎患者需使用阿片類藥物和麻醉劑，但服用阿片類藥物和麻醉劑會產(chǎn)生依賴性并造成惡心、便秘、嗜睡等不良反應(yīng)[7,8]。越來越多的研究表明許多來源于植物的天然化合物有助于各類疾病的治療。細(xì)胞凋亡異常是各類疾病的特質(zhì)之一。大量文獻(xiàn)報道多種植物提取物具有抑制細(xì)胞凋亡的功能。有研究表明生姜具有減弱IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的作用[8]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)水晶蘭苷可減弱IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡。據(jù)文獻(xiàn)報道姜黃素可以抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡[10]。有研究發(fā)現(xiàn)黃連素可抑制硝普酸鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡[11]。有數(shù)據(jù)顯示香葉木素可減輕缺血再灌注導(dǎo)致的小鼠腎臟細(xì)胞凋亡[12]。據(jù)報道香葉木素可降低阿霉素誘導(dǎo)的人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡的增加[13]。本文結(jié)果顯示，香葉木素會抑制IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的增加。

細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅱ型膠原和蛋白聚糖及細(xì)胞外基質(zhì)降解酶MMPs在骨關(guān)節(jié)炎中具有重要作用，在骨關(guān)節(jié)炎中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖通常會降低，MMPs會增加[14]。許多植物提取物可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)。有數(shù)據(jù)顯示杜仲水提取物可減弱骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜液中MMP-13水平的升高[15]。據(jù)報道在IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中，異澤蘭黃素可降低MMP-13水平[16]。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)在IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中，黃連素可提高Ⅱ型膠原蛋白水平。有研究表明羊棲菜提取物可抑制H2O2誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞Ⅰ和Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的降低以及MMP-3和 MMP-7表達(dá)的升高[18]。有數(shù)據(jù)顯示香葉木素可降低肝癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)[19]。據(jù)報道香葉木素可抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的慢性哮喘小鼠呼吸道MMP-9表達(dá)水平的升高[20]。本研究結(jié)果顯示，香葉木素可減弱IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞 Ⅱ 型膠原和蛋白聚糖蛋白水平的降低以及MMP-13 蛋白水平的升高。

越來越多的研究表明許多植物提取物具有很好的抗炎效果。有數(shù)據(jù)顯示胡椒堿可降低IL-1β誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NO和PGE2水平的升高[21]。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可降低IL-1誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NO的釋放[22]。有研究顯示石榴提取物可降低IL-1β誘導(dǎo)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞IL-6和PGE2水平的升高[23]。據(jù)文獻(xiàn)報道銀杏葉提取物EGb761可減弱LPS誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞NO、PGE2和IL-6水平的升高[24]。有研究發(fā)現(xiàn)含香葉木素的裂葉荊芥提取物可減弱卡拉膠誘導(dǎo)的足腫脹小鼠NO和TNF-α水平的升高[25]。據(jù)報道香葉木素可降低晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞NO和TNF-α的釋放[26]。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)香葉木素可抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中TNF-α和IL-6水平的升高。本文結(jié)果表明，香葉木素會抑制IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NO、PGE2和TNF-α的上升。

NF-κB通路在各種細(xì)胞進(jìn)程中起著重要作用，大量文獻(xiàn)報道植物提取物可影響NF-κB通路。有研究發(fā)現(xiàn)桑葉提取物抑制IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞NF-κB P65由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物EGb761可降低TNF-α誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞p-NF-κB P65蛋白水平，抑制NF-κB 通路的活化。據(jù)報道南山藤提取物可抑制IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞NF-κB P65磷酸化水平的升高[30]。有研究顯示香葉木素可減弱蛙皮素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中NF-κB P65由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)[31]。據(jù)文獻(xiàn)報道五味子提取物可降低IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞NF-κB P65由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)[32]。有研究表明香葉木素可抑制急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞中NF-κB P65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。本文結(jié)果顯示，香葉木素可降低IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞P65磷酸化水平的升高，減弱NF-κB P65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制NF-κB通路的活化。

本研究表明，在IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，香葉木素可改善細(xì)胞變形及細(xì)胞數(shù)目的下降，減輕細(xì)胞凋亡的增加，抑制Ⅱ型膠原和蛋白聚糖蛋白水平下降和MMP-13蛋白水平升高，降低NO、PGE2和TNF-α水平的上升，減弱NF-κB P65磷酸化水平的升高，抑制NF-κB P65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。綜上所述，香葉木素可通過抑制NF-κB通路活化緩解IL-1β誘導(dǎo)的新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)。下一步在動物模型上研究香葉木素對骨關(guān)節(jié)炎的影響，為開發(fā)新的有效的骨關(guān)節(jié)炎治療手段提供理論依據(jù)。