席云 朱冬林 董杰明 徐長志

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院，廣東 廣州 510530；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院)

慢性腎功能不全(CRF)又稱慢性腎衰竭，是指由多種原因造成慢性進行性腎實質(zhì)損害，致使腎臟明顯萎縮，不能維持其基本功能，臨床出現(xiàn)以代謝產(chǎn)物潴留，水、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào)，全身各系統(tǒng)受累為主要表現(xiàn)的臨床綜合征〔1〕。CRF發(fā)病率逐年增加，預(yù)后較差，嚴重危害患者生命〔2，3〕。因此,積極尋找有效的藥物來延緩CRF的進展尤為重要。本實驗研究硝克柳胺對CRF大鼠血清轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達及生存時間的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 雄性SD大鼠，體重(220±20)g，SPF級，購自華北理工大學(xué)動物實驗室。

1.1.2藥品與試劑 硝克柳胺(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物合成室提供，純度99.7%)； 腺嘌呤(上海源聚生物科技有限公司提供，純度>99%)；TGF-β1試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)；CTGF試劑盒(上海紀寧實業(yè)有限公司)；尿素氮(BUN)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；血肌酐(Scr)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 BIOBASE-EL10A全自動酶標儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；TG16B臺式高速離心機(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；大鼠用灌胃管〔東西儀(北京)科技有限公司〕；注射器等。

1.2分組及給藥 40只大鼠隨機分為4組：正常組、建模組〔4〕、低劑量硝克柳胺組(L組)、高劑量硝克柳胺組(H組)，每組10只。建模組、H組、L組給予腺嘌呤〔150 mg/(kg·d)〕灌胃12 w建立CRF模型；正常組給予同等劑量蒸餾水。L組大鼠給予硝克柳胺5 mg/(kg·d)，H組大鼠給予硝克柳胺10 mg/(kg·d)，均腹腔注射給藥。

1.3檢測指標 抽取各組大鼠治療1、3、5 w后靜脈血，離心，取血漿冷藏；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清TGF-β1、BUN、Scr、CTGF含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明執(zhí)行；觀察并記錄各組小鼠的生存時間，計算給藥組大鼠生命延長率，生命延長率=(給藥組生存天數(shù)-對照組生存天數(shù))/對照組生存天數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行方差檢驗、LSD-t、配對t檢驗、生存分析。

2 結(jié) 果

2.1各組TGF-β1、CTGF、BUN、Scr表達水平比較 正常組各時間點TGF-β1、CTGF、BUN、Scr含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；建模組、L組、H組不同時間點TGF-β1、CTGF、BUN、Scr含量均顯著高于正常組(均P<0.05)；L組、H組TGF-β1、CTGF、BUN、Scr含量均顯著低于建模組(均P<0.05)；H組不同時間點TGF-β1、CTGF、BUN、Scr含量均顯著低于L組(均P<0.05)。見表1、2、3、4。

表1 各組不同時間TGF-β1水平比較

與正常組比較：1)P<0.05；與建模組比較：2)P<0.05；與L組比較：3)P<0.05，下表同

表2 各組不同時間點CTGF水平比較

表3 各組不同時間點BUN水平比較

表4 各組不同時間點Scr水平比較

2.2各組生存時間比較 正常組大鼠全部存活。建模組最早出現(xiàn)死亡個體，且最早全部死亡，生存時間(41.40±6.39)d。L組生存時間(67.00±11.38)d，與建模組比較生命延長率為61.84%。H組生存時間(95.50±13.86)d，與建模組比較生命延長率130.68%。L組及H組生存時間顯著長于建模組，且L組顯著低于H組(均P<0.05)。

3 討 論

硝克柳胺是一種香豆素酰胺類小分子的新結(jié)構(gòu)化合物，相關(guān)研究表明其具有明確CRF治療作用且毒性低、活性較高〔5〕。動物實驗表明，硝克柳胺可明顯降低CRF大鼠BUN、Scr、血管緊張素Ⅱ、TGF-β1水平和尿蛋白水平，增加Scr清除率，其作用機制可能與抑制TGF-β1合成及受體結(jié)合有關(guān)〔6〕。

TGF-β1對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，可以①抑制免疫活性細胞增殖；②對細胞表型進行調(diào)節(jié)；③抑制淋巴細胞分化；④抑制細胞因子產(chǎn)生；⑤促進成纖維細胞、成骨細胞和雪旺細胞生長〔7〕。研究證實，TGF-β1與腎臟疾病進展密切相關(guān)。當腎小球或腎小管出現(xiàn)損傷后，炎性細胞侵入腎臟，導(dǎo)致TGF-β1水平升高，近而促進肌纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)(EMC)積聚〔8〕。CTGF具有明顯的絲裂原性和趨化性，能誘導(dǎo)成纖維細胞增殖和分泌ECM。CTGF作為TGF-β1的直接下游效應(yīng)介質(zhì)，可被TGF-β1調(diào)控CTGF啟動子內(nèi)TGF-β1反應(yīng)元件和Smad結(jié)合元件誘導(dǎo)CTGF的產(chǎn)生〔9〕。在多種纖維化疾病中，CTGF與TGF-β1的水平同步升高。BUN是血漿中除蛋白質(zhì)以外的一種含氮化合物，主要通過腎小球濾過作用排出體外。在腎功能不全失代償時，BUN將升高。所以臨床將其作為判斷腎小球濾過功能的指標。在腎功能損害早期，Scr、BUN均可在正常范圍內(nèi)，但當腎小球濾過率下降到正常的50%以下時，兩者的濃度會迅速升高〔10〕。

本實驗在構(gòu)建慢性腎功能不全大鼠模型后，未對4組大鼠腎損傷程度進行分組；同時，也由于實驗設(shè)計原因，未能解剖小鼠腎臟研究硝克柳胺對CRF大鼠的治愈效果，但本實驗通過觀察大鼠血清CRF的相關(guān)因子水平及大鼠生存時間，也在一定程度上彌補了本實驗設(shè)計的缺陷。綜上所述，硝克柳胺可有效降低CRF大鼠血清TGF-β1、CTGF、BUN、Scr表達水平，延長其生存時間。