成光宇 叢婷婷 呂美香 鄭菲菲 何澤

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長春 130021；2 2014級中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科碩士研究生；3 2016級中醫(yī)內(nèi)科碩士研究生；4附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病科)

糖尿病腎病(DN)是腎小球系膜細(xì)胞增殖、腎小球基底膜(GBM)增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增多和腎小球硬化等原因造成的〔1〕。足細(xì)胞為腎小球?yàn)V過屏障組成部分的重要結(jié)構(gòu)。解毒通絡(luò)保腎散是治療DN的有效中藥處方，臨床取得良好療效〔2〕。本實(shí)驗(yàn)主要探討解毒通絡(luò)保腎散對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 永分化小鼠足細(xì)胞(MPC-5)，購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，解毒通絡(luò)保腎散，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，低糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰酶(Gibco公司)，無水葡萄糖(北京化工廠)，磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone)，整合素連接激酶(ILK)、蛋白激酶B(Akt)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(貝博生物)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司)，超凈工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療)，酶標(biāo)儀(美國BIORAD)，流式細(xì)胞儀(美國BIORAD)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1小鼠足細(xì)胞的復(fù)蘇、凍存與傳代 細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇用含10%胎牛血清和 DMEM低糖培養(yǎng)基在33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中使其傳代增生，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2含藥血清的制備 解毒通絡(luò)保腎散由紅參10 g、生地黃15 g，枸杞子15 g，大黃12 g、黃芪15 g、金銀花15 g、地龍10 g、丹參15 g、黃連12 g、金蕎麥30 g組成。煎煮兩次濃縮直至含生藥1.125 g/ml。取Wistar大鼠16只,體重180～220 g，雄性，隨機(jī)分為空白組、解毒通絡(luò)保腎組。解毒通絡(luò)保腎組大鼠每日灌胃2次，每次3 ml，連續(xù)5 d，末次給藥1 h后腹主動脈取血，充分凝血后分離血清，56℃水浴滅活，-20℃冰箱保存?zhèn)溆??？瞻捉M大鼠灌服同等劑量的蒸餾水，與解毒通絡(luò)保腎組同時采血，分離血清備用。

1.3.3造模藥的配置 造模葡萄糖配置成最大濃度1 000 mmol/L，稱取1 g葡萄糖放入10 ml離心管，加入5 046 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝保存，用時稀釋至造模濃度180 mmol/L。

1.3.4實(shí)驗(yàn)分組 正常糖組(A組)：加低糖DMEM培養(yǎng)基；高糖組(B組)：以高糖180 mmol/L刺激；C組：高糖+低劑量含藥物血清組(0.60%)；D組：高糖+中劑量含藥物血清組(1.25%)；E組：高糖+高劑量含藥物血清組(2.50%)

1.3.5樣本采集 ①處理細(xì)胞：細(xì)胞消化、傳代方法及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法同1.3.1。②鋪板：將消化下來的細(xì)胞以1×105的濃度鋪至96孔板，每孔100 μl，留一列作為空白組，只加培養(yǎng)液100 μl。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。③加藥：設(shè)置空白孔、陰性對照孔、不同濃度含藥血清組?？瞻卓缀完幮詫φ湛准尤肱囵B(yǎng)液100 μl，造模樣品孔加入含藥血清和含葡萄糖的培養(yǎng)基100 μl使含藥血清終濃度為0.000%、0.625%、1.250%、2.500%，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。④處理：置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸出每孔的上清液，分裝在1.5 ml離心管中，做好標(biāo)記，封口膜封好每個離心管，將上清液凍存在-20℃冰箱中，等待下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測ILK、Akt 樣本孔中先加入待測樣本10 μl，再加入樣本稀釋液40 μl；空白孔不加。除空白孔以外，標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣本孔每孔各加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體 100 μl，并用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴箱中溫育60 min。棄去液體，用吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min 后，甩盡試劑盒孔內(nèi)液體，并用吸水紙拍干，如此反復(fù)洗板5次。每孔加入顯色劑A與顯色劑B各50 μl，37℃避光15 min。顯色后除空白孔外其余均顯藍(lán)色；每孔加入終止液50 μl，此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色；15 min內(nèi)，在 450 nm波長處測定各孔的光密度值(OD值)。

1.3.7流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡率 將足細(xì)胞接種于12孔板，分成5組，加藥方法同上，24 h后每孔加入300 μl胰酶，消化1 min后加入600 μl培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞收集至離心管中，每孔用預(yù)冷PBS沖洗1次，吹打后收集至上述離心管，500 r/min離心5 min后，棄上清液，用冷PBS洗細(xì)胞1次，吹打幾下后，1 500 r/min離心5 min后，棄上清液，用1×結(jié)合液重懸細(xì)胞，每管400 μl，在懸液中加入5 μl異硫氰酸熒光素(FITC)，2℃～8℃避光15 min，加入10 μl碘化丙啶(PI)，2℃～8℃避光5 min，用流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡率。

1.3.8統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組ILK及Akt表達(dá)及足細(xì)胞凋亡率比較 與A組相比，B、C、D、E組ILK表達(dá)均顯著增加(P<0.05，P<0.01)，與B組相比，C、D、E組ILK表達(dá)均降低，但只有D、E組差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；與A組比較，B、C、D、E組Akt表達(dá)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，與B組相比，C、D、E組Akt表達(dá)增加，但只有E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與A組相比，B、C、D、E組細(xì)胞凋亡率均顯著增加(均P<0.01)，與B組相比，C、D、E組細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.01)，與C組相比，D、E組凋亡率均顯著降低(均P<0.01)。見表1。

3 討 論

足細(xì)胞對維持腎小球?yàn)V過屏障的完整性起重要作用〔3〕。足細(xì)胞是避免機(jī)體蛋白質(zhì)丟失的最后一道屏障，足細(xì)胞損傷或丟失可導(dǎo)致大量蛋白尿及腎小球硬化。足細(xì)胞是DM多種致病因素作用的靶點(diǎn)，同時也是DN重要的致病因素。

DN的主要病機(jī)是“毒損腎絡(luò)”，消渴病日久，氣血運(yùn)行失常，產(chǎn)生氣滯、痰凝、血瘀等病理產(chǎn)物。這些病理產(chǎn)物日久則會化生為毒邪，毒邪入侵浮絡(luò)、孫絡(luò)等傷及腎臟及腎絡(luò)，導(dǎo)致腎臟功能與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而發(fā)生DN〔4〕。ILK是一種存在于胞質(zhì)內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的連接細(xì)胞內(nèi)外信號的蛋白激酶，研究發(fā)現(xiàn)，ILK激活直接導(dǎo)致足細(xì)胞的丟失〔5〕。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信號通路是影響細(xì)胞凋亡的重要途徑之一〔6〕，受體酪氨酸激酶與其配體結(jié)合發(fā)生磷酸化后激活PI3K，PI3K 活化后磷脂酰肌醇二磷酸(PIP)2生成磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PIP3和Akt N端的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上進(jìn)一步被磷酸化，并作用于下一蛋白，發(fā)揮作用。

前期實(shí)驗(yàn)證明解毒通絡(luò)保腎散可以抑制實(shí)驗(yàn)性DM大鼠腎臟肥大及高濾過，保護(hù)腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能〔7〕，本實(shí)驗(yàn)通過高糖刺激小鼠腎足細(xì)胞發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞凋亡率升高，說明確實(shí)發(fā)生了DN，符合了中醫(yī)毒損腎絡(luò)、腎之體用俱損機(jī)制。本研究說明在高糖的刺激下ILK-P13K-AKt信號通路已經(jīng)活化，凋亡已經(jīng)開始發(fā)生。解毒通絡(luò)保腎散能夠減少ILK并增加Akt的表達(dá)，初步證明解毒通絡(luò)保腎散對高糖刺激的足細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制可能阻斷ILK介導(dǎo)的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制足細(xì)胞凋亡，延緩DN的發(fā)生發(fā)展。