馮雪松 魯明騫 陸海燕 蘇 進(jìn) 郭 蓉

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤防治中心 宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 宜昌 443000)

乳腺癌全球發(fā)病率及死亡率分別超過20%和10%〔1〕。目前乳腺癌治療包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療，但治療效果有時亦不太理想。長期持續(xù)放化療會導(dǎo)致一定毒副反應(yīng)且降低患者抵抗力而殺傷癌細(xì)胞治療效果也較差〔2,3〕。徐兵河〔4〕在中國腫瘤臨床中對乳腺癌的靶向治療進(jìn)行了總結(jié)，主要體現(xiàn)在激素受體陽性乳腺癌的內(nèi)分泌靶向治療和表皮生長因子受體(HER)-2陽性乳腺癌的靶向治療上。然而臨床上使用曲妥珠單抗治療HER2陽性、早期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌，可從中獲益的患者不足35%〔5〕。并且新出現(xiàn)的耐藥問題也是亟待解決的問題。

乳腺癌組織中具有眾多差異性表達(dá)的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，不同種類的lncRNA通過干擾mRNA的剪切，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，X染色體沉默及基因組印記等多種方式對乳腺癌發(fā)生發(fā)展等過程產(chǎn)生影響〔6〕。此外，目前多種lncRNA在相應(yīng)的惡性腫瘤中作為分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)的潛能也得到了驗(yàn)證〔7～9〕，因此，基因組學(xué)研究將為乳腺癌的檢測、診斷、治療靶點(diǎn)的選擇及預(yù)后情況的判斷等提供了新的可行性方案。本文總結(jié)了目前國內(nèi)外關(guān)于乳腺癌中差異表達(dá)并具有不同作用的lncRNA，擬為乳腺癌的早期診斷及治療提供特異有效的靶點(diǎn)。

1 lncRNA概述

人類對基因組學(xué)的研究既往主要著眼于具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，不能編碼蛋白質(zhì)的RNA被認(rèn)為是無用RNA，稱為轉(zhuǎn)錄噪聲。然而就是這些RNA在細(xì)胞的增殖、分化、衰老和凋亡等生命活動中發(fā)揮著不可或缺的作用。其實(shí)從哺乳動物基因組學(xué)顯示，僅有較少的轉(zhuǎn)錄本有編碼蛋白質(zhì)的功能，剩下的絕大部分為非編碼RNA(ncRNA)，約占人類基因組80%。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的大小可以分為兩大類，microRNA和lncRNA。其中長度大于200 nt的非編碼RNA，稱為lncRNA〔10〕。Ponting等〔11〕研究lncRNA的演變及其在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳學(xué)基因調(diào)節(jié)及疾病中的角色時推測lncRNA可能有5種不同的起源：①蛋白質(zhì)編碼基因序列中斷產(chǎn)生；②通過染色質(zhì)重排產(chǎn)生；③ 通過非編碼RNA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座復(fù)制產(chǎn)生；④含有相鄰重復(fù)序列的非編碼序列基因串聯(lián)產(chǎn)生；⑤通過基因組中插入一個轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。然而目前關(guān)于lncRNA的起源仍沒有確定的理論。對于lncRNA的生物學(xué)功能機(jī)制，主要通過信號分子、誘餌分子、引導(dǎo)分子、支架分子和復(fù)合分子在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及作為結(jié)構(gòu)RNA在細(xì)胞增殖、分化、衰老、死亡及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔12〕。根據(jù)其作用及在腫瘤組織中的表達(dá)模式，可分為促癌作用的lncRNA和抑癌作用的lncRNA及兼具促癌作用和抑癌作用的lncRNA。

2 lncRNA 與乳腺癌

目前研究發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的lncRNA有以下幾種：HOX反義基因間RNA(HOTAIR),H19,肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1,類固醇受體RNA激活因子(SRA),腦胞質(zhì)RNA200(BC200),LOC554202,LncRNA-ROR,JADE,應(yīng)激誘導(dǎo)長非編碼轉(zhuǎn)錄本(LSINCT)5,結(jié)腸相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(CCAT)2,尿路上皮癌抗原(UCA)1,生長阻滯特異轉(zhuǎn)錄本(GAS)5,母本印記表達(dá)基因(MEG)3,失活X染色體特異轉(zhuǎn)錄體(XIST),ZFAS1,轉(zhuǎn)移抑制lncRNA(LIMT),阿霉素耐藥相關(guān)非編碼RNA(ARA)等。并且有研究發(fā)現(xiàn)在浸潤性乳腺癌中HOTAIR和H19的表達(dá)水平比導(dǎo)管癌中更高；MALAT1在所有類型細(xì)胞中都高表達(dá)；而ZFAS1在所有細(xì)胞樣本中均只微弱表達(dá)〔13〕。它們在乳腺癌的促癌、抑癌、侵襲、轉(zhuǎn)移及藥物敏感性等方面發(fā)揮重要作用，見表1。

表1 乳腺癌中常見異常lncRNA的不同作用

2.1乳腺癌中發(fā)揮促癌作用的lncRNA HOTAIR是在人成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)且以反義方式轉(zhuǎn)錄的lncRNA，在乳腺癌及其轉(zhuǎn)移部位中均可檢測到它的表達(dá)異常升高，高表達(dá)的HOTAIR會導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)，與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)〔14〕，從而導(dǎo)致患者生存率降低及預(yù)后欠佳。而HOTAIR作為乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)，Gokmen-Polar等〔15〕認(rèn)為僅適用于ER受體陰性且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的乳腺癌患者。因此，HOTAIR作為乳腺癌預(yù)后指標(biāo)的意義相對來說比較局限。當(dāng)然也有不同的觀點(diǎn)存在，Milevskiy等〔16〕在對乳腺癌相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析時發(fā)現(xiàn)，在HER2受體豐富的腫瘤中HOTAIR與叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(FOX)A1和FOXM1共表達(dá)，這些因素增強(qiáng)了HOTAIR在侵襲性HER2陽性乳腺癌中的預(yù)后檢測能力。

lncRNA H19是發(fā)現(xiàn)得最早的一個與腫瘤相關(guān)的lncRNA，它在某些腫瘤中既有促癌作用也有抑癌作用，但目前沒有H19在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用的報道。多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)H19對乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展均有重要作用，因?yàn)闊o論在乳腺癌原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶中H19均表達(dá)增高〔17〕，高表達(dá)的H19會縮短細(xì)胞周期，加速乳腺癌細(xì)胞的增殖；并且高表達(dá)的H19與雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)存在關(guān)聯(lián)性〔18〕，作為miR-675的前體可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔19〕。Sun等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)H19在ER陽性乳腺癌中的表達(dá)量是在ER陰性乳腺癌中的10倍，提示H19可能是雌激素誘導(dǎo)基因或者與ER相互作用。H19 在乳腺癌和正常組織的差異表達(dá)為乳腺癌的診斷提供了新的生物標(biāo)志物，并可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

MALAT-1于2003年通過測序和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測被發(fā)現(xiàn)。Miao等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常組織，MALAT-1在80%以上的癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在乳腺癌組織中高表達(dá)的MALAT-1與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。如果抑制乳腺癌組織中MALAT-1的表達(dá)，則乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲明顯受限，并可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。并且乳腺癌患者血清中的MALAT-1水平明顯高于其在良性乳腺疾病中的血清水平，且其診斷效果相當(dāng)可觀。Zhao等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)在ER陽性的乳腺癌細(xì)胞中，使用高濃度的雌二醇(E2)治療和單獨(dú)剔除MALAT-1后發(fā)現(xiàn)MALAT-1表達(dá)水平顯著下降，并且細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低，表明其可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，MALAT-1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用，其在血清中的水平可能成為乳腺診斷的一個新的腫瘤標(biāo)記物。

SRA是在乳腺癌中高表達(dá)的lncRNA中發(fā)現(xiàn)得較早的一類，它可以調(diào)節(jié)類固醇受體和類固醇受體激活蛋白(SEAP)的表達(dá)水平，并與ER-α和PR等協(xié)同調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的侵襲性〔23〕。Liu等〔24〕發(fā)現(xiàn)SRA相關(guān)信號通路在雌激素依耐性乳腺癌中扮演著重要角色，更多的數(shù)據(jù)顯示SRA的表達(dá)水平可以作為ER陽性乳腺癌的一個新的預(yù)后指標(biāo)。

BC200可作為雌激素依耐性乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)以及減低細(xì)胞增殖能力的作用靶標(biāo)。Singh等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)BC200在ER陽性乳腺癌中的表達(dá)水平明顯高于ER陰性乳腺癌，并且敲除BC200會導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降。表明BC200在乳腺癌組織中的高表達(dá)有促癌作用。在侵襲性乳腺癌中BC200也是呈現(xiàn)出高表達(dá)的水平，表明其與乳腺癌的轉(zhuǎn)移也存在相關(guān)性。

乳腺癌中還有多種lncRNA均呈現(xiàn)高表達(dá)，LOC554202與晚期病例分期和腫瘤大小相關(guān)，在體外敲除LOC554202會降低細(xì)胞增殖擴(kuò)散的能力，抑制細(xì)胞侵襲，在體內(nèi)抑制腫瘤發(fā)生〔26〕。LincRNA-ROR在三陰性乳腺癌和轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，通過以ADP核糖基化因子(ARF)6為靶標(biāo)調(diào)節(jié)乳腺癌的侵襲性〔27〕；且其也可以和不均一核糖核蛋白相互作用抑制p53對DNA損害的反應(yīng)。JADE可誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)中組蛋白H4的甲基化，異常調(diào)節(jié)參與乳腺癌的發(fā)生〔28〕。LSINCT5在乳腺癌組織中高表達(dá)，敲除LSINCT5則細(xì)胞的增殖能力下降，表明具有其促癌作用〔29〕。Cai等〔30〕通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌組織中高表達(dá)，異常表達(dá)可影響Wnt信號通路，敲除CCAT2可抑制細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。UCA1能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞由上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通過增強(qiáng) Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路提高乳腺癌細(xì)胞的侵襲性〔31〕。

目前發(fā)現(xiàn)的這些在乳腺癌中具有促癌作用的lncRNA增加了乳腺癌的患病風(fēng)險，因此可通過相關(guān)的途徑抑制這些lncRNA的表達(dá)從而緩解乳腺癌發(fā)生發(fā)展。但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

2.2乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用的lncRNA GAS5是在NIH3T3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，對哺乳動物細(xì)胞的生長阻滯有調(diào)控作用。其在多種不同類型的腫瘤中表達(dá)降低，研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡刺激物的敏感性的作用，其表達(dá)降低促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括乳腺癌〔32,33〕。并且由于GAS5表達(dá)下調(diào)多發(fā)生在乳腺癌的Ⅰ期和Ⅱ期，所以GAS5有可能成為預(yù)測乳腺癌分期的標(biāo)記物之一〔34〕。這為乳腺癌的治療提供了一種新的治療思路，即誘導(dǎo)GAS5在乳腺癌中強(qiáng)制表達(dá)起到抑制乳腺癌的作用，目前研究發(fā)現(xiàn)可通過聯(lián)合使用傳統(tǒng)化學(xué)藥物和雙重磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)抑制劑〔35〕、干擾Notch途徑〔36〕及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑〔37〕起到強(qiáng)制GAS5表達(dá)的作用。

MEG3是第一個被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的lncRNA，其在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，通過DNA甲基化的方式抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。目前研究表明，MEG3還參與到p53的抑癌機(jī)制中抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等。Sun等〔38〕研究了MEG3對乳腺癌細(xì)胞MCF7和MB231的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的MEG3可以通過增強(qiáng)MDM2的轉(zhuǎn)錄水平激活p53的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，并發(fā)現(xiàn)MEG3在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)可影響乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

XIST是由失活X染色體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的lncRNA，對于女性細(xì)胞的X染色體失活具有重要意義。Huang等〔39〕敲除或高表達(dá)XIST 會導(dǎo)致Akt磷酸化作用和細(xì)胞的生存能力相應(yīng)增高和降低，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中XIST和Akt的磷酸化作用呈負(fù)相關(guān)。因此，XIST主要通過抑制Akt激活而調(diào)控細(xì)胞的生存能力，進(jìn)而在乳腺癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用。

ZFAS1在正常乳腺組織和乳腺癌組織中差異表達(dá)。Askarian-Amiri等〔40〕通過研究ZFAS1的同源基因ZFAS1在小鼠乳腺中的作用發(fā)現(xiàn)ZFAS1在人乳腺癌中可能是一個抑癌基因。

此外，還有一些lncRNA可以抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移從而發(fā)揮抑癌作用。HIT可調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程，剔除HIT則能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移〔41〕。BCAR4可誘導(dǎo)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子促使p300組蛋白乙酰化而激活非經(jīng)典hedgehog/GLI2信號通路參與乳腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程的調(diào)控〔42〕。NKILA能與NF-κB/人核因子κB抑制蛋白(IκB)結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制IKB激酶(IKK)誘導(dǎo)的IB磷酸化和NF-κB信號通路的活化，進(jìn)而抑制乳腺癌的進(jìn)展〔43〕。LIMT以前被命名為LINC01089，是一種高度保守的lncRNA，在侵襲性乳腺癌中可通過表皮細(xì)胞生長因子(EGF)及抑制其對刺激的反應(yīng)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移〔44〕。

同樣的，這些抑癌作用的lncRNA可以抑制乳腺癌的增殖轉(zhuǎn)移，因此，可通過不同的途徑在乳腺癌中使其強(qiáng)制表達(dá)提高表達(dá)水平從而起到抑制乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移的作用，為臨床上治療乳腺癌提供可供選擇的治療方法及提供可用于靶向治療的作用靶點(diǎn)。

2.3乳腺癌中發(fā)揮耐藥作用的lncRNA ARA由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PAK)3基因內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來，在靈長類動物中含有保守、穩(wěn)定的序列。通過對lncRNA行芯片分析證實(shí)ARA的表達(dá)與乳腺癌和肝癌對阿霉素的敏感性相關(guān)。在體外下調(diào)ARA的表達(dá)，可降低細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期停留在G2/M期，并使腫瘤轉(zhuǎn)移能力受限。此外，通過對轉(zhuǎn)錄組行芯片分析發(fā)現(xiàn)ARA可以參與多種促阿霉素耐藥的信號通路，其中包括MAPK信號通路，新陳代謝信號通路，細(xì)胞周期與細(xì)胞黏附相關(guān)生物通路及調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程包括轉(zhuǎn)錄進(jìn)程和蛋白質(zhì)加工功能等。由此推測ARA與乳腺癌的耐藥相關(guān)〔45〕。

Zhu等〔46〕通過使用阿霉素治療抵抗的乳腺癌細(xì)胞作為模型系統(tǒng)研究了lncRNA H19在化療耐藥性發(fā)展中的作用和分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)H19表達(dá)在蒽環(huán)類抗生素治療后和阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中顯著增加。并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)明H19主要通過H19-CUL4A-ABCB1/多耐藥基因(MDR)1途徑在乳腺癌化療耐藥中起主導(dǎo)作用。此外，Si等〔47〕發(fā)現(xiàn)LncRNA H19通過促凋亡基因Bcl-2誘導(dǎo)凋亡基因(BIK)的表觀遺傳沉默導(dǎo)致ER-α陽性乳腺癌中的化學(xué)治療抵抗。

為了研究哪種lncRNA的失調(diào)造成曲妥珠單抗耐藥，Li等〔48〕通過篩選了一組涉及到曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞SKBR-3/Tr的lncRNA微陣列，發(fā)現(xiàn)在曲妥珠單抗治療后的乳腺癌患者組織和SKBR-3/Tr細(xì)胞中GAS5的表達(dá)降低。提示曲妥珠單抗可減少GAS5的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)拉帕替尼可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路上調(diào)GAS5的表達(dá)，GAS5作為miR-21的一個競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)，競爭性結(jié)合miR-21以增加張力蛋白同源物(PTEN)促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。這一過程改善了乳腺癌曲妥珠單抗的治療抵抗。最終得出結(jié)論，GAS5可改善HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗的治療抵抗。這項(xiàng)工作提示GAS5可作為HER2陽性乳腺癌的新型預(yù)后指標(biāo)和候選藥物靶標(biāo)，并提高曲妥珠單抗耐藥患者的治療效果。

綜上，未來可通過不同的作用靶點(diǎn)改善臨床上乳腺癌的治療抵抗，從而提高乳腺癌的治療效果。但具體的作用機(jī)制及減弱或強(qiáng)制其表達(dá)的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。這也為臨床研究提供參考的額依據(jù)和方向。